مقدمه:روشهاي سنتي اصلاح نباتات مبتني بر دستكاري ساختار ژنتيكي گياه كامل و از طريق توليد جنسي است. در سالهاي اخير روشي براي دستكاري ژنتيكي در سطح سلولي پيدا شده است كه روشهاي اصلاحي را بطور منحصر بفرد كامل مي كند. موجوديت پيدا كردن روشهاي كشت بافت و سلول را مي توان به پيشرفتهاي ناشي از دانش كشت سلولي و زيست شناسي مولكولي دانست (4 و 51)بيوتكنولوژي يا فناوري زيستي مجموعه اي از فنون را تشكيل مي دهد كه امكان بكارگيري، توانايي و كارآيي سلولهاي موجودات زنده اعم از حيواني يا گياهي را فراهم مي سازد. در سالهاي اخير با انجام تحقيقات متعدد در حوزة بيوتكنولوژي كشاورزي اين بخش داراي جايگاه مهم و باارزشي شده است و اين امكان را در رابطه با گياهان زراعي فراهم نموده است كه بسيار مطالب كارآتر از روشهاي كلاسيك اصلاح نباتات با استفاده از تكنيكهاي مختلف از قبيل دست ورزي ژنتيكي (Genetic manipulation)، كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro و غيره، گياهاني با سازگاري متناسب تر و بيشتر به شرايط محيطي و همچنين سازگار با نياز انسانها توليد نمايد.تكنيك كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro ازجمله فنون بيوتكنولوژي است كه كاربرد آن به اوايل سالهاي 1950 مي رسد. بر اساس اين تكنيك، سلول گياهي يا بافت از اندامهايي مثل ريشه، ساقه، برگ و گل آذين يا هر اندام ديگري از گياه جدا شده و در شرايط كاملاً استريل و گندزدايي شده، در درون لوله هاي آزمايش محتوي محيط غذايي مصنوعي قرار گرفته و با تأمين نيازهاي نوري و حرارتي مناسب تبديل به يك گياه كامل مي گردد. اين تكنيك همانطور كه اشاره شد امكان توليد هزاران گياهچه مشابه گياه مادري را در مدت زمان بسيار كوتاهي و در فضاي فيزيكي بسيار محدودي فراهم ميسازد كه با انتقال اين گياهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه توليد انبوهي از گياهان مورد نظر را مي توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تكنيك كشت بافت و نيز توليد كالوس يا گياهچه ها در مقياس وسيع و انجام گزينش در بين نمونه ها مي توان از ارقام مقاوم به استرسهاي محيطي را توليد نمود. فنون فوق فرصتهاي مناسبي در بخشهاي مختلف تحقيقاتي، اقتصادي بوجود آورده است كه با تقويت بخش دولتي و فعال نمودن بخش خصوصي كارايي اين بخشها را براي تأمين و توليد محصولات اساسي كشور را، بطور قابل ملاحظه اي مي توان افزايش داد. تعداد صفحات 123 word فصل اول مقدمه و كليات.. 1مقدمه: 2تاريخچة اهميت كشت بافت: 3اساس گياه شناسي براي كشت بافت: 6اهداف مورد نياز با استفاده از تكنولوژيهاي جديد كشت بافت و مهندسي ژنتيك: 6فصل دوم 8خصوصيات زراعي. 8تاريخچه: 9اهميت اقتصادي: 10گياهشناسي يونجه: 11آب و هوا: 14كاربرد بيوتكنولوژي در اصلاح يونجه: 15مهندسي ژنتيك: 16هيبريداسيون گسترده: 17فصل سوم 18كشت بافت.. 18كشت بافت يونجه: 19جنين زايي. 21باززايي. 24اثرات زمينه ژرم پلاسم در باززائي: 28انواع كشت بافت گياهي: 36كشت سوسپانسيون: 37مراحل رشد كشت سلولي: 38بذر مصنوعي يونجه و كاربرد آن: 39كاربرد بيوتكنولوژي: 40پتانسيل بذور مصنوعي: 40كاربرد بذر مصنوعي: 41امكانات مورد نياز براي كشت بافت و سلول گياهي: 43اطاق كشت: 45مواد و روشها: 46انتخاب ارقام يونجه: 46تهيه محيط كشت: 47روش تهيه محيط كشت MS: 49محيط كشت: 53- سترون كردن محيط كشت، ظروف پتري و ساير لوازم: 54روش تهيه محيط كشت SH: 54محلولهاي ذخيره: 54سترون كردن محيط كشت، ظروف پتري و ساير لوازم: 56بافت گياهي: 57برگ جوان وهيپوكوتيل: 58روش تهيه محيط كشت B5: 62محيط باززايي: 64محيط تبديل به گياه: 65محيط كشت سوسپانسيون: 65محاسبات آماري: 65فصل چهارم 67بحث و نتيجهگيري. 67بحث و نتيجه گيري: 68انتخاب ارقام يونجه: 68محيط القاء كال: 68الف – مقايسه اثر ريزنمونه در رشد كالوسها: 73بررسي اثر ارقام در رشد كالوسها: 75بررسي اثر متقابل سطوح هورموني مختلف با ريزنمونه در رشد كالوسها: 75محيط القاء جنين: 76بررسي تأثير نوع محيطهاي كشت در جنين زايي: 80بررسي تأثير سطوح هورموني در جنين زايي: 80بررسي اثر رقم در جنين زايي: 81محيط باززايي: 81محيط تبديل به گياه: 82كشت سوسپانسيون: 85بحث و نتيجه گيري و پيشنهادات: 86منابع: 92جداول پيوست.. 107 فهرست جداول جدول 1- تركيبات معدني محيط كشت پاية MS برحسب ميلي گرم در ليتر. 57جدول 2- مواد آلي تكميل كننده و هورمون در محيط هاي كشت بر حسب ميلي گرم در ليتر 57جدول 3- تجزيه واريانس داده هاي مربوط به رشد كالوس در محيط ها، ارقام يونجه و ريزنمو نه هاي مختلف 113جدول 4-مقايسه ميانگين بين ريزنمونه ازلحاظ رشدكال درسطح احتمال 5%. 114جدول 5- مقايسه بين ارقام يونجه از لحاظ رشد كالوس در سطح احتمال 5%. 114جدول 6- مقايسه ميانگين تركيبات تيماري سطوح هورموني و ريزنمونه از لحاظ رشد كالوس (5%P<) از طريق آزمون دانكن 115جدول 8-تجزيه واريانس جنين زايي: 116جدول 9-مقايسه ميانگين بين محيطهاي كشت B5 و MS در جنين زايي. 116جدول 10-مقايسه سطوح هورموني در جنين زايي در سطح احتمال 5%. 117جدول11-مقايسه ميانگين جنينزايي در ارقام يونجه 119جدول 12- جدول تجزيه واريانس باززايي در ارقام يونجه 119جدول 13- مقايسه ميانگين بين ارقام از لحاظ باززايي در سطح احتمال 5%. 120جدول 14- مقايسه ميانگين ريزنمونه از لحاظ باززايي در سطح احتمال 5%. 120جدول15-جدولتجزيه واريانستوليدگياهچهدرمحيط كشت بافت درارقام يونجه 122جدول 16- جدول مقايسه ميانگين ارقام از لحاظ توليد گياهچه 122جدول 17- جدول تحزيه واريانس جنين زايي در سه رقم يونجه در محيط كشت سوسپانسيون 123جدول 18- جدول مقايسه ميانگين ارقام از لحاظ جنين زايي در محيط كشت سوسپانسيون. 123 فهرست اشکالشكل 2 : كاشت بذر هاي استريل در محيط كشت هورمون دار 76شكل 3: نمونه از كالوس آبدار و غير جنين زا 76شكل 4: نمونه از كالوس غير جنين زا 77شكل 5: نمونه اي از كالوسهاي جنين زا 78شكل 6: شروع تشكيل كال در ريز نمونه بذر 78شكل 7: نمونه اي از كالوسهاي حاصل از كاشت بذر 79شكل8: تشكيل جنين كروي شكل. 83شكل 9: تشكيل جنين لپه اي شكل. 84شكل 10: تشكيل جنين نيزه اي شكل. 85شكل 11: ريشه زايي در محيط تبديل به گياهچه 89شكل 12: رشد ريشه در محيط تبديل به گياه 90شكل 13: شاخه زايي در محيط تبديل گياهچه 90شكل14: نمونه از توليد شاخه و ريشه 91شكل 15: نمونه اي از كشت سوسپانسيون. 94شكل 16: نمونه اي از كالوس جنين زا در كشت سوسپانسيون. 95شكل17: جوانه زني جنين در محيط سوسپانسيون. 95شكل 18: ايجاد شاخه در محيط كشت سوسپانسيون. 96شكل 18: نمونه اي از مراحل تكاملي جنين در محيط سوسپانسيون. 97
مقدمه:روشهاي سنتي اصلاح نباتات مبتني بر دستكاري ساختار ژنتيكي گياه كامل و از طريق توليد جنسي است. در سالهاي اخير روشي براي دستكاري ژنتيكي در سطح سلولي پيدا شده است كه روشهاي اصلاحي را بطور منحصر بفرد كامل مي كند. موجوديت پيدا كردن روشهاي كشت بافت و سلول را مي توان به پيشرفتهاي ناشي از دانش كشت سلولي و زيست شناسي مولكولي دانست (4 و 51)بيوتكنولوژي يا فناوري زيستي مجموعه اي از فنون را تشكيل مي دهد كه امكان بكارگيري، توانايي و كارآيي سلولهاي موجودات زنده اعم از حيواني يا گياهي را فراهم مي سازد. در سالهاي اخير با انجام تحقيقات متعدد در حوزة بيوتكنولوژي كشاورزي اين بخش داراي جايگاه مهم و باارزشي شده است و اين امكان را در رابطه با گياهان زراعي فراهم نموده است كه بسيار مطالب كارآتر از روشهاي كلاسيك اصلاح نباتات با استفاده از تكنيكهاي مختلف از قبيل دست ورزي ژنتيكي (Genetic manipulation)، كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro و غيره، گياهاني با سازگاري متناسب تر و بيشتر به شرايط محيطي و همچنين سازگار با نياز انسانها توليد نمايد.تكنيك كشت بافت و سلول گياهي در شرايط In Vitro ازجمله فنون بيوتكنولوژي است كه كاربرد آن به اوايل سالهاي 1950 مي رسد. بر اساس اين تكنيك، سلول گياهي يا بافت از اندامهايي مثل ريشه، ساقه، برگ و گل آذين يا هر اندام ديگري از گياه جدا شده و در شرايط كاملاً استريل و گندزدايي شده، در درون لوله هاي آزمايش محتوي محيط غذايي مصنوعي قرار گرفته و با تأمين نيازهاي نوري و حرارتي مناسب تبديل به يك گياه كامل مي گردد. اين تكنيك همانطور كه اشاره شد امكان توليد هزاران گياهچه مشابه گياه مادري را در مدت زمان بسيار كوتاهي و در فضاي فيزيكي بسيار محدودي فراهم ميسازد كه با انتقال اين گياهچه ها به سطح گلخانه و مزرعه توليد انبوهي از گياهان مورد نظر را مي توان باعث شد. در اصلاح نباتات با استفاده از تكنيك كشت بافت و نيز توليد كالوس يا گياهچه ها در مقياس وسيع و انجام گزينش در بين نمونه ها مي توان از ارقام مقاوم به استرسهاي محيطي را توليد نمود. فنون فوق فرصتهاي مناسبي در بخشهاي مختلف تحقيقاتي، اقتصادي بوجود آورده است كه با تقويت بخش دولتي و فعال نمودن بخش خصوصي كارايي اين بخشها را براي تأمين و توليد محصولات اساسي كشور را، بطور قابل ملاحظه اي مي توان افزايش داد. تعداد صفحات 123 word فصل اول مقدمه و كليات.. 1مقدمه: 2تاريخچة اهميت كشت بافت: 3اساس گياه شناسي براي كشت بافت: 6اهداف مورد نياز با استفاده از تكنولوژيهاي جديد كشت بافت و مهندسي ژنتيك: 6فصل دوم 8خصوصيات زراعي. 8تاريخچه: 9اهميت اقتصادي: 10گياهشناسي يونجه: 11آب و هوا: 14كاربرد بيوتكنولوژي در اصلاح يونجه: 15مهندسي ژنتيك: 16هيبريداسيون گسترده: 17فصل سوم 18كشت بافت.. 18كشت بافت يونجه: 19جنين زايي. 21باززايي. 24اثرات زمينه ژرم پلاسم در باززائي: 28انواع كشت بافت گياهي: 36كشت سوسپانسيون: 37مراحل رشد كشت سلولي: 38بذر مصنوعي يونجه و كاربرد آن: 39كاربرد بيوتكنولوژي: 40پتانسيل بذور مصنوعي: 40كاربرد بذر مصنوعي: 41امكانات مورد نياز براي كشت بافت و سلول گياهي: 43اطاق كشت: 45مواد و روشها: 46انتخاب ارقام يونجه: 46تهيه محيط كشت: 47روش تهيه محيط كشت MS: 49محيط كشت: 53- سترون كردن محيط كشت، ظروف پتري و ساير لوازم: 54روش تهيه محيط كشت SH: 54محلولهاي ذخيره: 54سترون كردن محيط كشت، ظروف پتري و ساير لوازم: 56بافت گياهي: 57برگ جوان وهيپوكوتيل: 58روش تهيه محيط كشت B5: 62محيط باززايي: 64محيط تبديل به گياه: 65محيط كشت سوسپانسيون: 65محاسبات آماري: 65فصل چهارم 67بحث و نتيجهگيري. 67بحث و نتيجه گيري: 68انتخاب ارقام يونجه: 68محيط القاء كال: 68الف – مقايسه اثر ريزنمونه در رشد كالوسها: 73بررسي اثر ارقام در رشد كالوسها: 75بررسي اثر متقابل سطوح هورموني مختلف با ريزنمونه در رشد كالوسها: 75محيط القاء جنين: 76بررسي تأثير نوع محيطهاي كشت در جنين زايي: 80بررسي تأثير سطوح هورموني در جنين زايي: 80بررسي اثر رقم در جنين زايي: 81محيط باززايي: 81محيط تبديل به گياه: 82كشت سوسپانسيون: 85بحث و نتيجه گيري و پيشنهادات: 86منابع: 92جداول پيوست.. 107 فهرست جداول جدول 1- تركيبات معدني محيط كشت پاية MS برحسب ميلي گرم در ليتر. 57جدول 2- مواد آلي تكميل كننده و هورمون در محيط هاي كشت بر حسب ميلي گرم در ليتر 57جدول 3- تجزيه واريانس داده هاي مربوط به رشد كالوس در محيط ها، ارقام يونجه و ريزنمو نه هاي مختلف 113جدول 4-مقايسه ميانگين بين ريزنمونه ازلحاظ رشدكال درسطح احتمال 5%. 114جدول 5- مقايسه بين ارقام يونجه از لحاظ رشد كالوس در سطح احتمال 5%. 114جدول 6- مقايسه ميانگين تركيبات تيماري سطوح هورموني و ريزنمونه از لحاظ رشد كالوس (5%P<) از طريق آزمون دانكن 115جدول 8-تجزيه واريانس جنين زايي: 116جدول 9-مقايسه ميانگين بين محيطهاي كشت B5 و MS در جنين زايي. 116جدول 10-مقايسه سطوح هورموني در جنين زايي در سطح احتمال 5%. 117جدول11-مقايسه ميانگين جنينزايي در ارقام يونجه 119جدول 12- جدول تجزيه واريانس باززايي در ارقام يونجه 119جدول 13- مقايسه ميانگين بين ارقام از لحاظ باززايي در سطح احتمال 5%. 120جدول 14- مقايسه ميانگين ريزنمونه از لحاظ باززايي در سطح احتمال 5%. 120جدول15-جدولتجزيه واريانستوليدگياهچهدرمحيط كشت بافت درارقام يونجه 122جدول 16- جدول مقايسه ميانگين ارقام از لحاظ توليد گياهچه 122جدول 17- جدول تحزيه واريانس جنين زايي در سه رقم يونجه در محيط كشت سوسپانسيون 123جدول 18- جدول مقايسه ميانگين ارقام از لحاظ جنين زايي در محيط كشت سوسپانسيون. 123 فهرست اشکالشكل 2 : كاشت بذر هاي استريل در محيط كشت هورمون دار 76شكل 3: نمونه از كالوس آبدار و غير جنين زا 76شكل 4: نمونه از كالوس غير جنين زا 77شكل 5: نمونه اي از كالوسهاي جنين زا 78شكل 6: شروع تشكيل كال در ريز نمونه بذر 78شكل 7: نمونه اي از كالوسهاي حاصل از كاشت بذر 79شكل8: تشكيل جنين كروي شكل. 83شكل 9: تشكيل جنين لپه اي شكل. 84شكل 10: تشكيل جنين نيزه اي شكل. 85شكل 11: ريشه زايي در محيط تبديل به گياهچه 89شكل 12: رشد ريشه در محيط تبديل به گياه 90شكل 13: شاخه زايي در محيط تبديل گياهچه 90شكل14: نمونه از توليد شاخه و ريشه 91شكل 15: نمونه اي از كشت سوسپانسيون. 94شكل 16: نمونه اي از كالوس جنين زا در كشت سوسپانسيون. 95شكل17: جوانه زني جنين در محيط سوسپانسيون. 95شكل 18: ايجاد شاخه در محيط كشت سوسپانسيون. 96شكل 18: نمونه اي از مراحل تكاملي جنين در محيط سوسپانسيون. 97