عنوان صفحهچكيده 1فصل اول: مقدمهدلايل عمده عملكرد پايين قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در ايران 8فصل دوم: بررسي منابعتاريخچه پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 10آشنايي اجمالي با قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 12طبقهبندي 12رده بندي 12اندام شناسي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 13مشخصات پرگنه در كشت خالص 15نامگذاري علمي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: 15تقسيم بندي واحدهاي سلولي ميسليوم از لحاظ تعداد و تركيببندي هستهاي 16چرخ زندگي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 16بررسي الگوهاي چرخه زندگي در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 19الف ـ هموتاليسم 19ب ـ هتروتاليسم 20ژنتيك قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 22روشهاي بهبود نژادي در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: 24كشت بافت 25گزينش از طريق كشت تك اسپوري 26تهيه نقش اسپور 26الف ـ كشت و گزينش تك اسپوري 26ب ـ كشت و گزينش چند اسپوري 27اختلاط ساده 28تلاقي هدفمند هموكاريونها 28بدست آوردن هموكاريون و تاييد آنها 291ـ روش سنتي تأييد هموكاريونها 292ـ تهيه و تاييد هموكاريونهاي والدي به روش تهيه پروتوپلاست 303ـ تاييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RFLP 304ـ تاييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RAPD 31انجام تلاقي بين هموكاريونها و تاييد هيبريدها: 32الف ـ استفاده از نشانگرهاي غذايي براي تاييد هيبريدها: 33ب ـ استفاده از آيزوزايمها براي تاييد هيبريدها: 34ج ـ استفاده از نشانگرهاي مقاومت براي تأييد هيبريدها 34اصلاح برخي صفات با استفاده از روش تلاقي هيبريدها: 34د ـ استفاده از نشانگرهاي مورفولوژيكي براي تاييد هيبريدها: 35مراحل انجام آزمون اصلاحي از طريق دورگگيري هدفمند: 351ـ كشت اسپور 352ـ جداسازي تك اسپورها 363ـ تهيه اسپاون 36آزمون ميوهدهي 36الف ـ تهيه بستر كشت: 36ب ـ مراحل پرورش و ميوهدهي: 37توليد پريمورديا در سطح محيط كشت: 38توليد اجسام ميوه دهي در اسپاون 38ج ـ توليد اندام باردهي در كمپوست 39مهندسي ژنتيك 391ـ انتقال ژن 392ـ اختلاط پروتوپلاستها 40فصل سوم: مواد و روشهاتهيه نژادها 42روش تهيه محيط كشت غذايي PDA 42روش كشت هموكاريونها 43روش تلاقي هموكاريونها 44نمونهگيري از منطقه تلاقي 45تهيه اسپاون مادري از هيبريدها 45تلقيح دانههاي گندم با كشت هيبريد 46تهيه بستر كشت (كمپوست) 47الف ـ پاستوريزاسيون و آمونياكزدايي 49ب ـ مايهزني كمپوست 49ج ـ خاكدهي بستر كشت 49هوادهي و افت سريع دما 50محاسبه قابليت تركيبپذيري عمومي و خصوصي 53محاسبه واريانس تركيب پذيريي عمومي و خصوصي 53محاسبه واريانس افزايشي و غالبيت 53فصل چهارم نتايج و بحثنتايج بررسي سرعت رشد (قطر پرگنه هموكاريونها) 55تيپ رشدي پرگنه هموكاريون 55نتايج سرعت رشد در هتروكاريونها 59نتايج مشاهدهاي تهيه اسپاون 60نتايج مشاهداي آزمون ميوهدهي 60جدول تجزيه واريانس براي صفت عملكرد در دورگها 61جدول قابليت تركيبپذيري عمومي در هموكاريونها 64جدول قابليت تركيبپذيري خصوصي دورگها 64جدول مقادير اجزاء ژنتيكي 66ضريب همبستگي 66پيشنهادات 67منابع 69پيوست 75چكيده انگليسي 78 امروزه تأمين غذا و بويژه پروتئين در كشورهاي در حال توسعه به يكي از مسائل بنيادي تبديل شده است. پروتئين مورد نياز انسان از دو منبع اساسي شامل منابع حيواني و ديگري منابع گياهي قابل تأمين است. پروتئين گياهي شامل حبوبات، غلات و ميوهجات و سبزيجات است و پروتئين حيواني عمدتاً شامل گوشت دامها، طيور، آبزيان و فراوردههاي لبني و دامي ميباشد. در ايران، كمبود ميزان بارش ساليانه، تخريب اراضي كشاورزي، جنگلها و مراتع، آلودگي بيش از حد منابع آبي، عدم استفاده صحيح و اصولي از نهادههاي زراعي و مهمتر از همه سوء مديريت، باعث مشكلات زيادي در تأمين پروتئين شده است. هم اكنون كشور ما بيش از 65 ميليون جمعيت دارد و پيشبيني ميشود تا سال 1400 هجري شمسي اين رقم به80 ميليون نفر برسد. با افزايش روزافزون جمعيت و تغيير الگوي مصرف مقدار غذاي سرانه و مصرف كل غذا افزايش خواهد يافت. با توجه به مشكلات فوق، در آينده يكي از بحرانيترين مسائل كشور ما، مسئله تأمين پروتئين خواهد بود. در اين ميان توليد و پرورش قارچ خوراكي از چند نظر حائز اهميت است، كه عبارتند از: 1ـ تأثير اندك شرايط محيطي و آب و هوايي بر پرورش قارچ خوراكي: قارچ خوراكي در بيشتر مناطق آب و هوايي كشور بدون تجهيزات و امكانات ويژه قابل پرورش است. زيرا توليد و پرورش آن در مكانهاي كنترل شده و سربسته صورت ميگيرد. همچنين پرورش قارچ از لحاظ صرفهجويي در استفاده از زمين، قابل توجه ميباشد. 2ـ صرفه اقتصادي: براي توليد و پرورش قارچ خوراكي از بقاياي گياهي محصولات كشاورزي از قبيل كاه و كلش و ساير مواد زايد گياهي استفاده ميشود و نيز كمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، ميتواند به عنوان كود آلي مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گيرد. از سوي ديگر تهية منابع پروتئيني ديگر، در مقايسه با قارچ، هزينه بشتري دارد.3ـ ارزش غذايي:قارچ خوراكي با ميزان پروتئين 30ـ25 درصدي همرديف حبوبات و بالاتر از سبزيجات و ميوهها قرار دارد. همچنين هضم 80ـ70 درصدي پروتئين قارچ حائز اهميت است و ميزان كربوهيدراتها و كلسترول در آن پايين است. به دليلي پايين بودن كالري در قارچ يك رژيم غذايي مناسب براي لاغري است. قارچهاي خوراكي داراي تركيبات ضدسرطان نيز ميباشند. با مصرف قارچهاي خوراكي ميتوان ويتامينهاي C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدني مانند پتاسيم، كلسيم، فسفر و مقاديري آهن مورد نياز بدن را تأمين كرد. برخي از اسيدهاي آمينه در قارچ خوراكي شامل ليزين، تريپتوفان، تريپسين و اسيد فوليك ميباشد (محمدي گل تپه، 1379).همچنين مقايسه برخي از اسيدآمينههاي موجود در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با تخممرغ، كه يك منبع غذايي غني از پروتئين ميباشد، در جدول 2 آمده است (چنگ و مايلز، 1989)[1]. جدول 1ـ ارزش غذايي قارچ خوراكي تازه به شرح جدول زير ميباشد (غلامعلي پيوست، 1375).درصـدمـاده5/90ـ3/78آب30ـ25پروتئين (وزن خشك)5/3پروتئين (وزن تر)8ـ7/1چربي (وزن خشك)3/0ـ2/0چربي (وزن تر)1ـ8/0نمكهاي معدني12ـ7/7خاكستر (وزن خشك)368ـ328انرژي (k cal در 100 گرم) جدول 2ـ مقايسه برخي از اسيدهاي آمينه موجود در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با تخممرغ: (در 100 گرم پروتئين)قارچ تكمهاي سفيدتخممرغاسيد آمينه5/78/8لوسين5/46/6ايزولوسين5/23/7والين26/1تريپتوفان1/94/6ليزين2/48/5فنيل آلانين9/01/3متيونين 4ـ اشتغالزايي: چنانچه در زمينه ترويج، توسعه و حمايت از پرورش قارچ خوراكي در مناطق مختلف كشور بخصوص روستاها فعاليت شود، ميتوان علاوه بر تأمين مواد غذايي گام مؤثري در جهت ايجاد اشتغال جنبي مناسب و افزايش درآمد كشاورزان برداشت.در بين قارچهاي خوراكي، قارچ تكمهاي سفيد رايجترين قارچي است كه در سراسر جهان كشت ميشود. پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در اواسط قرن هفدهم ميلادي در فرانسه شروع شده و از دهة 1960 توليد آن به صورت صنعت بزرگي، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 38 درصد كل توليد قارچ خوراكي در دنيا را، به خود اختصاص داده است (دفتر امور گل و گياهان زينتي و قارچهاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382).عليرغم اهميت اقتصادي و تجاري قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، برنامه اصلاحي براي بهبود عملكرد آن، با مشكلاتي همراه است. يكي از مهمترين مشكلات، به چرخه نامعمول زندگي اين قارچ برميگردد كه غالباً بجاي تشكيل بازيديوسپورهاي تك هستهاي، بازيديوسپورهايي حاوي دو هسته هاپلوئيد متفاوت و سازگار از نظر جنسي، توليد ميكند (استوپ و مايبروك، 1999)[2]. مشكل ديگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژيكي قابل مشاهده، بين ميسليومهاي با منشأ تك اسپوري و چند اسپوري ميباشد (كريگان، 1992)[3]. همچنين از نظر تندش اسپور، كه به عنوان اولين گام در يك برنامه اصلاحي است، بسيار ضعيف و ناهماهنگ است (چنگ و مايلز، 1989)[4]. از دهة 1970 ميلادي، الگوي جنسي و چرخه كامل زندگي اين قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در دنيا، در حدود 5/2 كيلوگرم است در حالي كه اين ميزان در ايران، تنها 160 گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در ايالات متحد امريكا حدود يك كيلوگرم ميباشد. ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در آلمان، در سال 1959، حدود 5100 تن و در سال 1965، حدود 9000 تن و در سال 1967، به مرز 15000 تن رسيد در سال 1969 ارزش نقدي توليد جهاني اين قارچ از مرز يك ميليارد مارك گذشته بود (غلامعلي پيوست، 1375).ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي در ايران، در حدود12 هزار تن است كه از اين ميزان، حدود 10 هزار تن به قارچ تكمهاي سفيد اختصاص دارد. حدود صد واحد توليدي فعال و نيمه فعال قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در ايران شناسايي شدهاند. گرچه آمار و ارقام دقيق و قابل اعتمادي از ميزان عملكرد قارچ خوراكي در ايران در دست نيست، ولي براساس شواهد موجود، عملكرد در ايران، حدود 12 كيلوگرم در مترمربع است، در حاليكه متوسط عملكرد جهاني قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در حدود 25 كيلوگرم در مترمربع ميباشد (دفتر امور گل و گياهان زينتي و قارچهاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382).طبق آمار موجود، كشورهاي توليدكننده قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در جدول 3و4 آمدهاند.توليد قارچ تكمهاي سفيد (هزار تن)كشور875اروپا425آمريكاي شمالي330چين68آسيا51آمريكاي لاتين توليد قارچ تكمهاي سفيد (هزار تن)كشور246ايالات متحده آمريكا160فرانسه140چين90هلند84انگلستان به علت نبود مراكز تحقيقاتي در ايران و عدم توجه كافي مراكز علمي و دانشگاهي كشور به اين تكنولوژي سودآور و پرمنفعت، پرورش قارچ خوراكي نتوانسته جايگاه واقعي خود را پيدا كند علاوه بر اين بيتوجهي مراكز تحقيقات كشاورزي موجب عدم تربيت نيروي متخصص لازم و كافي براي پرورش و توليد قارچ خوراكي شده است. دلايل عمده عملكرد پايين قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در ايران: 1ـ عدم تهيه يك بستر كشت مناسب تهيه و آمادهسازي بستر كشت، (كمپوست) از مهمترين مراحل پرورش قارچ خوراكي است، زيرا تغذيه قارچ خوراكي از بستر كشت تأمين ميشود و قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، يك تجزيه كننده ثانويه ميباشد و از اجساد ميكروارگانيسمهاي موجود در كمپوست نيز استفاده ميكند.2ـ عدم رعايت بهداشت محيط 3ـ عدم كنترل دقيق شرايط محيطي، در زمان پرورش قارچ4ـ ضعف بنيه نژادي استفاده پياپي و تكثير رويشي اسپاون با همان روشهاي قديمي، منجر به ضعيف شدن قدرت رويشي اسپاون و كاهش شديد عملكرد آن، شده است. اسپاون وارداتي با زير كشتهاي متوالي، ضعيف ميشود. همچنين ممكن است اسپاون وارداتي نامرغوب باشد، لذا توليد اسپاون مرغوب در داخل كشور، امري ضروري است. در همين راستا از حدود هفت سال پيش، تحقيقات در زمينه توليد اسپاون هيبريد، در دانشكده كشاورزي (گروه بيوتكنولوژي) دانشگاه فردوسي مشهد، آغاز شده است.تاريخچه پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: كشت قارچ تكمهاي سفيد، در قرن هفدهم ميلادي در حومه پاريس بوسيله باغبانان فرانسوي در هواي آزاد، صورت گرفت، با كشف اين نكته، كه وجود نور براي رشد اين قارچ، ضروري نيست و در تاريكي هم ميتوانند رشد نمايند. در اوايل قرن نوزدهم كشت و پرورش قارچ، در غارهاي طبيعي، معادن و تونلهاي حفر شده در فرانسه، توسعه زيادي پيدا كرد. كشت و پرورش قارچ، در اوايل نيمه دوم قرن 19 از اروپا به ايالات متحده امريكا سرايت كرد و در سال 1890، مزرعهداران ايالت پنسيلوانياي امريكا، به پرورش قارچ در فضاهاي سرپوشيده اشتغال ورزيدند. اين كار به سرعت در ساير مناطق رايج شده و متعاقب آن سالنهاي ويژهاي براي پرورش قارچ خوراكي احداث شد (سينگر و هريس، 1987) [1].با گسترش علم زيستشناسي و اختراع و پيشرفت ميكروسكوپ و روشهاي ميكروبيولوژيكي كاشت و پرورش قارچهاي خوراكي، توجه دانشمندان به اين موضوع بيشتر جلب شد. در سال 1884 دانشمنداني از جمله مارچوت و كنستانتين، موفق به توليد اسپاون استريل، توسط جوانه زني توده اسپورهاي اين قارچ، در شرايط آزمايشگاهي شدند. در سال 1905 داگر موفق به تهيه اسپاون قارچ تكمهاي گرديد و مطالعات خود را براي تهيه بذر خالص قارچ، از كشت بافت منتشر كرد و بدين ترتيب اولين گام در اصلاح قارچ تكمهاي، برداشته شد. از سال 1910 به بعد، كشت و توليد اين قارچ در گلخانه و محيطهاي كنترل شده رواج پيدا كرد. در سال 1920، كشاورزان اروپايي، به علت تغيير وسائل نقليه از اسب به ماشين، به فكر تهيه كمپوست از منابع جديد، (كاه و كلش و كود مرغ) به جاي كمپوست اسبي افتادند. لامبرت از ايالات متحده امريكا، اساس تكنولوژي نوين امروزي پرورش قارچ خوراكي را، بنيان نهاد. وي در سال 1932 تهيه بذر قارچ بر روي غلات را ابداع نمود (لامبرت، 1932). انقلاب صنعتي كه سيندر طي سالهاي 1938 تا 1946 در تهيه كمپوست مصنوعي، براي صنعت پرورش قارچهاي خوراكي بوجود آورد، در واقع، دومين قدم در اصلاح اين قارچ بوده است (سيندر، 1938)[2]. بنا به گزارش پاتاك و همكاران، از دهه 1960، توسعه توليد و پرورش قارچ خوراكي بويژه تكمهاي سفيد، به شيوة مدرن، در اكثر كشورها، بويژه در ايالات متحده امريكا آغاز گرديد (پاتاك و همكاران، 1960)[3]. در اواخر دهه 1970 و اوايل دهه 1980 فريش، طي يك برنامه اصلاحي بلندمدت، موفق به گزينش و معرفي نژادهاي U1 و U3 گرديد، كه نقطه عطفي در اصلاح قارچ مذكور است (فريش، 1983)[4].در ايران، از سال 1376 نخستين گامهاي اصلاحي، براي بهبود نژادي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در دانشكده كشاورزي مشهد برداشته شده است. طي سالهاي 79ـ1377 نخستين فرايند اصلاحي با بهينهسازي شرايط كشت تك اسپور، آغاز شد (گردان، 1379). در سالهاي 82ـ1380 با بهينه سازي شناخت هموكاريونها، با استفاده از نشانگر ملكولي RAPD گامي مؤثر، در جهت تسريع فرايند اصلاحي قارچ تكمهاي سفيد، برداشته شد (كاووسي، 1382).در سالهاي 83ـ1381 شاخصههاي اصلاحي بر عملكرد قارچ خوراكي تكهاي سفيد، مورد بررسي قرار گرفت (خاتمي، 1383). در اين تحقيق كه از سال 1382 آغاز شده است، به بررسي قابليت تركيب پذيري عمومي و خصوصي در ده ايزوله خالص هموكاريون پرداخته شده است، تا در نهايت بتوانيم بهترين ايزوله هموكاريون براي تركيب با ساير هموكاريونها را بشناسيم و همچنين، از بين تمامي تلاقيهاي دو به دو بدست آمده، بهترين دورگ با بيشترين عملكرد را، معرفي كنيم. اميد است، نتايج حاصل از اين تحقيق گامي در جهت پيشبرد اصلاح اين قارچ، باشد. آشنايي اجمالي با قارچ خوراكي تكمهاي سفيد:قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با نام علمي Agaricus bisporus و نام انگليسي The White Button Mushroom شناخته ميشود.طبقهبندي:كليه موجوداتي كه قارچ ناميده ميشوند، در سه سلسله جداگانه قرار ميگيرند (جان و همكاران، 1996)[5].1ـ سلسله Fungi 2ـ سلسله Stramenopila 3ـ سلسله Protistaقارچ خوراكي تكمهاي سفيد، يك قارچ عالي، متعلق به سلسله Fungi است.رده بندي:سلسله: Fungi شاخه: Basidiomycotaرده: Hymenomyceteراسته: Agaricaleخانواده: Agaricaceaجنس: Agaricusگونه:Bisporus قارچها، فاقد كلروفيل هستند و براي بقاء خود، متكي به وجود مواد آلي هستند، يعني به اصطلاح، هترو تروف[6] ميباشند.چنانچه مواد آلي مورد نياز قارچها فقط از گياهان مرده جذب گردد، به آنها، گندرو[7] ميگويند. قارچ خوراكي تكمهاي سفيد فقط از بقاياي گياهان تغذيه ميكند، بنابراين يك قارچ گندرو ميباشد (جان و همكاران، 1996)[8].اصطلاح Mushroom به اندام گوشتي توليد كننده اسپور قارچها، اطلاق ميشود و ميتوان گفت كه ماشرومها خوراكي[9] يا سمي[10] هستند. در شاخه Basidiomycota قارچهاي خوراكي جنس Agaricus، Pleurotus، VolvariellaوLentinus بيشتر مورد توجه هستند. اندام شناسي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: اصطلاح تكمهاي از شكل ظاهري اين قارچ در هنگام جواني، گرفته شده است. هرچند كه اين مرحله ناپايدار است و قارچ در مرحله بلوغ، به حالتي چتري در ميآيد. به طور كلي يك قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، از دو قسمت عمده تشكيل شده است. قسمت چتري كه به صورت كلاهك[11] پهن است و قسمت دوم، پايه[12] كه كلاهك را نگه ميدارد (گوپتا، 1988)[13]. پايه قارچ دو وظيفه را عهدهدار است. اولاً، كاملاً توپر است تا بتواند كلاهك را، محكم نگه دارد. ثانياً، كلاهك قارچ را، از سطح زمين بالا برده، به طوريكه اسپورها شانس مناسبي براي قرارگرفتن در جريان هوا داشته باشند و موقعيت مناسب و مؤثري براي پراكنده شدن اسپورها، ايجاد سازد (اينگلد، 1996)[14].اسپورها بر روي تيغهها قرار دارند و تيغهها در سطح زيرين كلاهك جاي دارند. در هنگام جواني، كلاهك قارچ توسط يك غشاء[15] كه بين كلاهك و پايه تشكيل ميشود پوشيده شده است اين غشاء پس از پاره شدن، اطراف پايه را فرا ميگيرد كه حلقه[16] ناميده ميشود. در قارچA.bisporus، كلاهك به رنگ سفيد، كرم يا قهوهاي رنگ و تقريباً صاف و نرم و در بعضي موارد، داراي پولكهاي كوچك است. سطح كلاهك در اين قارچ، محدب است كه در نهايت كاملاً پهن و گوشتي ميشود. پايه به صورت مركزي، سفيد و استوانهاي و محكم است كه در قسمت تحتاني آن ضخيمتر بوده و به تدريج كه به سمت بالا ميآيد باريكتر ميشود. وسيله تكثير اين قارچ، اسپور است كه در حقيقت، همان بازيديوسپورها[17] هستند. بازيديوسپورها در سطح خارجي تيغههاي[18] كلاهك به صورت يك لايه به نام هيمينيوم[19] تشكيل ميشوند. بازيديومها سلولهايي هستند كه، بازيديوسپورها بر روي آنها قرار دارند (جندرز، 1982)[20] مشخصات پرگنه در كشت خالص: پرگنه يا كلني[21]، تودة ميسليومي رشد يافته است و ميتوان، آن را در محيط كشت غذايي به اشكال مختلف رشتهاي، پنبهاي، نمدي و بدون ميسليوم هوايي مشاهده نمود. ميسليومها ضمن رشد انتهايي، انشعابات متعدد نيز توليد ميكنند، كه مطلوبترين شكل رشد ميسليومها به صورت رشتهاي و داراي ميسليوم هوايي است، كه اين موضوع در عملكرد قارچ حائز اهميت است (لامبرت و همكاران، 1983)[22] مشاهده شده است كه برخي از نژادهاي اين قارچ، پرگنه خاكستري مايل به سفيد و ميسليوم هوايي كمتري توليد ميكنند و گروهي ديگر، ميسليوم هوايي زياد توليد كرده و شكل پنبهاي به خود ميگيرند (كليگمن، 1943)[23] [1]-Singer & Harris, 1987[2]-Sinder, 1938[3]-Pathak et al . 1960[4]-Fritsch, 1983[5]-John et al. 1996[6]-Heterotroph[7]-Saprophyte[8]- John et al. 1996[9]-Edible[10]-Poisonous[11]-Cap[12]-Stipe[13]-Gupta, 1993[14]- Ingold, 1996[15]-veil[16]-Annulus[17]-Basidiospore[18]-Gills[19]-Hymenium[20]-Genders, 1982[21]-Colony[22]-Lambert et al., 1983[23]- Kligman, 1943
مقاله 35- بررسی قابليت تركيب پذيری عمومی و خصوصی براي صفت عملكرد در 10 ايزوله خالص هموكاريون قارچ خوراكي تكمه ای
عنوان صفحهچكيده 1فصل اول: مقدمهدلايل عمده عملكرد پايين قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در ايران 8فصل دوم: بررسي منابعتاريخچه پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 10آشنايي اجمالي با قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 12طبقهبندي 12رده بندي 12اندام شناسي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 13مشخصات پرگنه در كشت خالص 15نامگذاري علمي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: 15تقسيم بندي واحدهاي سلولي ميسليوم از لحاظ تعداد و تركيببندي هستهاي 16چرخ زندگي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 16بررسي الگوهاي چرخه زندگي در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 19الف ـ هموتاليسم 19ب ـ هتروتاليسم 20ژنتيك قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 22روشهاي بهبود نژادي در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: 24كشت بافت 25گزينش از طريق كشت تك اسپوري 26تهيه نقش اسپور 26الف ـ كشت و گزينش تك اسپوري 26ب ـ كشت و گزينش چند اسپوري 27اختلاط ساده 28تلاقي هدفمند هموكاريونها 28بدست آوردن هموكاريون و تاييد آنها 291ـ روش سنتي تأييد هموكاريونها 292ـ تهيه و تاييد هموكاريونهاي والدي به روش تهيه پروتوپلاست 303ـ تاييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RFLP 304ـ تاييد هموكاريونها با استفاده از نشانگر RAPD 31انجام تلاقي بين هموكاريونها و تاييد هيبريدها: 32الف ـ استفاده از نشانگرهاي غذايي براي تاييد هيبريدها: 33ب ـ استفاده از آيزوزايمها براي تاييد هيبريدها: 34ج ـ استفاده از نشانگرهاي مقاومت براي تأييد هيبريدها 34اصلاح برخي صفات با استفاده از روش تلاقي هيبريدها: 34د ـ استفاده از نشانگرهاي مورفولوژيكي براي تاييد هيبريدها: 35مراحل انجام آزمون اصلاحي از طريق دورگگيري هدفمند: 351ـ كشت اسپور 352ـ جداسازي تك اسپورها 363ـ تهيه اسپاون 36آزمون ميوهدهي 36الف ـ تهيه بستر كشت: 36ب ـ مراحل پرورش و ميوهدهي: 37توليد پريمورديا در سطح محيط كشت: 38توليد اجسام ميوه دهي در اسپاون 38ج ـ توليد اندام باردهي در كمپوست 39مهندسي ژنتيك 391ـ انتقال ژن 392ـ اختلاط پروتوپلاستها 40فصل سوم: مواد و روشهاتهيه نژادها 42روش تهيه محيط كشت غذايي PDA 42روش كشت هموكاريونها 43روش تلاقي هموكاريونها 44نمونهگيري از منطقه تلاقي 45تهيه اسپاون مادري از هيبريدها 45تلقيح دانههاي گندم با كشت هيبريد 46تهيه بستر كشت (كمپوست) 47الف ـ پاستوريزاسيون و آمونياكزدايي 49ب ـ مايهزني كمپوست 49ج ـ خاكدهي بستر كشت 49هوادهي و افت سريع دما 50محاسبه قابليت تركيبپذيري عمومي و خصوصي 53محاسبه واريانس تركيب پذيريي عمومي و خصوصي 53محاسبه واريانس افزايشي و غالبيت 53فصل چهارم نتايج و بحثنتايج بررسي سرعت رشد (قطر پرگنه هموكاريونها) 55تيپ رشدي پرگنه هموكاريون 55نتايج سرعت رشد در هتروكاريونها 59نتايج مشاهدهاي تهيه اسپاون 60نتايج مشاهداي آزمون ميوهدهي 60جدول تجزيه واريانس براي صفت عملكرد در دورگها 61جدول قابليت تركيبپذيري عمومي در هموكاريونها 64جدول قابليت تركيبپذيري خصوصي دورگها 64جدول مقادير اجزاء ژنتيكي 66ضريب همبستگي 66پيشنهادات 67منابع 69پيوست 75چكيده انگليسي 78 امروزه تأمين غذا و بويژه پروتئين در كشورهاي در حال توسعه به يكي از مسائل بنيادي تبديل شده است. پروتئين مورد نياز انسان از دو منبع اساسي شامل منابع حيواني و ديگري منابع گياهي قابل تأمين است. پروتئين گياهي شامل حبوبات، غلات و ميوهجات و سبزيجات است و پروتئين حيواني عمدتاً شامل گوشت دامها، طيور، آبزيان و فراوردههاي لبني و دامي ميباشد. در ايران، كمبود ميزان بارش ساليانه، تخريب اراضي كشاورزي، جنگلها و مراتع، آلودگي بيش از حد منابع آبي، عدم استفاده صحيح و اصولي از نهادههاي زراعي و مهمتر از همه سوء مديريت، باعث مشكلات زيادي در تأمين پروتئين شده است. هم اكنون كشور ما بيش از 65 ميليون جمعيت دارد و پيشبيني ميشود تا سال 1400 هجري شمسي اين رقم به80 ميليون نفر برسد. با افزايش روزافزون جمعيت و تغيير الگوي مصرف مقدار غذاي سرانه و مصرف كل غذا افزايش خواهد يافت. با توجه به مشكلات فوق، در آينده يكي از بحرانيترين مسائل كشور ما، مسئله تأمين پروتئين خواهد بود. در اين ميان توليد و پرورش قارچ خوراكي از چند نظر حائز اهميت است، كه عبارتند از: 1ـ تأثير اندك شرايط محيطي و آب و هوايي بر پرورش قارچ خوراكي: قارچ خوراكي در بيشتر مناطق آب و هوايي كشور بدون تجهيزات و امكانات ويژه قابل پرورش است. زيرا توليد و پرورش آن در مكانهاي كنترل شده و سربسته صورت ميگيرد. همچنين پرورش قارچ از لحاظ صرفهجويي در استفاده از زمين، قابل توجه ميباشد. 2ـ صرفه اقتصادي: براي توليد و پرورش قارچ خوراكي از بقاياي گياهي محصولات كشاورزي از قبيل كاه و كلش و ساير مواد زايد گياهي استفاده ميشود و نيز كمپوست مصرف شده در پرورش قارچ، ميتواند به عنوان كود آلي مرغوب در باغها و مراتع مورد استفاده قرار گيرد. از سوي ديگر تهية منابع پروتئيني ديگر، در مقايسه با قارچ، هزينه بشتري دارد.3ـ ارزش غذايي:قارچ خوراكي با ميزان پروتئين 30ـ25 درصدي همرديف حبوبات و بالاتر از سبزيجات و ميوهها قرار دارد. همچنين هضم 80ـ70 درصدي پروتئين قارچ حائز اهميت است و ميزان كربوهيدراتها و كلسترول در آن پايين است. به دليلي پايين بودن كالري در قارچ يك رژيم غذايي مناسب براي لاغري است. قارچهاي خوراكي داراي تركيبات ضدسرطان نيز ميباشند. با مصرف قارچهاي خوراكي ميتوان ويتامينهاي C,E,K,D,A و گروه (B6, B2, B1) B و املاح معدني مانند پتاسيم، كلسيم، فسفر و مقاديري آهن مورد نياز بدن را تأمين كرد. برخي از اسيدهاي آمينه در قارچ خوراكي شامل ليزين، تريپتوفان، تريپسين و اسيد فوليك ميباشد (محمدي گل تپه، 1379).همچنين مقايسه برخي از اسيدآمينههاي موجود در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با تخممرغ، كه يك منبع غذايي غني از پروتئين ميباشد، در جدول 2 آمده است (چنگ و مايلز، 1989)[1]. جدول 1ـ ارزش غذايي قارچ خوراكي تازه به شرح جدول زير ميباشد (غلامعلي پيوست، 1375).درصـدمـاده5/90ـ3/78آب30ـ25پروتئين (وزن خشك)5/3پروتئين (وزن تر)8ـ7/1چربي (وزن خشك)3/0ـ2/0چربي (وزن تر)1ـ8/0نمكهاي معدني12ـ7/7خاكستر (وزن خشك)368ـ328انرژي (k cal در 100 گرم) جدول 2ـ مقايسه برخي از اسيدهاي آمينه موجود در قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با تخممرغ: (در 100 گرم پروتئين)قارچ تكمهاي سفيدتخممرغاسيد آمينه5/78/8لوسين5/46/6ايزولوسين5/23/7والين26/1تريپتوفان1/94/6ليزين2/48/5فنيل آلانين9/01/3متيونين 4ـ اشتغالزايي: چنانچه در زمينه ترويج، توسعه و حمايت از پرورش قارچ خوراكي در مناطق مختلف كشور بخصوص روستاها فعاليت شود، ميتوان علاوه بر تأمين مواد غذايي گام مؤثري در جهت ايجاد اشتغال جنبي مناسب و افزايش درآمد كشاورزان برداشت.در بين قارچهاي خوراكي، قارچ تكمهاي سفيد رايجترين قارچي است كه در سراسر جهان كشت ميشود. پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در اواسط قرن هفدهم ميلادي در فرانسه شروع شده و از دهة 1960 توليد آن به صورت صنعت بزرگي، درآمده است. در مجموع به طور متوسط قارچ خوراكي تكمهاي سفيد 38 درصد كل توليد قارچ خوراكي در دنيا را، به خود اختصاص داده است (دفتر امور گل و گياهان زينتي و قارچهاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382).عليرغم اهميت اقتصادي و تجاري قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، برنامه اصلاحي براي بهبود عملكرد آن، با مشكلاتي همراه است. يكي از مهمترين مشكلات، به چرخه نامعمول زندگي اين قارچ برميگردد كه غالباً بجاي تشكيل بازيديوسپورهاي تك هستهاي، بازيديوسپورهايي حاوي دو هسته هاپلوئيد متفاوت و سازگار از نظر جنسي، توليد ميكند (استوپ و مايبروك، 1999)[2]. مشكل ديگر، عدم وجود اختلافات مورفولوژيكي قابل مشاهده، بين ميسليومهاي با منشأ تك اسپوري و چند اسپوري ميباشد (كريگان، 1992)[3]. همچنين از نظر تندش اسپور، كه به عنوان اولين گام در يك برنامه اصلاحي است، بسيار ضعيف و ناهماهنگ است (چنگ و مايلز، 1989)[4]. از دهة 1970 ميلادي، الگوي جنسي و چرخه كامل زندگي اين قارچ به دقت مورد مطالعه قرار گرفته است. متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در دنيا، در حدود 5/2 كيلوگرم است در حالي كه اين ميزان در ايران، تنها 160 گرم است و متوسط سرانه مصرف قارچ خوراكي در ايالات متحد امريكا حدود يك كيلوگرم ميباشد. ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در آلمان، در سال 1959، حدود 5100 تن و در سال 1965، حدود 9000 تن و در سال 1967، به مرز 15000 تن رسيد در سال 1969 ارزش نقدي توليد جهاني اين قارچ از مرز يك ميليارد مارك گذشته بود (غلامعلي پيوست، 1375).ميزان توليد ساليانه قارچ خوراكي در ايران، در حدود12 هزار تن است كه از اين ميزان، حدود 10 هزار تن به قارچ تكمهاي سفيد اختصاص دارد. حدود صد واحد توليدي فعال و نيمه فعال قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در ايران شناسايي شدهاند. گرچه آمار و ارقام دقيق و قابل اعتمادي از ميزان عملكرد قارچ خوراكي در ايران در دست نيست، ولي براساس شواهد موجود، عملكرد در ايران، حدود 12 كيلوگرم در مترمربع است، در حاليكه متوسط عملكرد جهاني قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در حدود 25 كيلوگرم در مترمربع ميباشد (دفتر امور گل و گياهان زينتي و قارچهاي خوراكي وزارت جهاد كشاورزي، 1382).طبق آمار موجود، كشورهاي توليدكننده قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در جدول 3و4 آمدهاند.توليد قارچ تكمهاي سفيد (هزار تن)كشور875اروپا425آمريكاي شمالي330چين68آسيا51آمريكاي لاتين توليد قارچ تكمهاي سفيد (هزار تن)كشور246ايالات متحده آمريكا160فرانسه140چين90هلند84انگلستان به علت نبود مراكز تحقيقاتي در ايران و عدم توجه كافي مراكز علمي و دانشگاهي كشور به اين تكنولوژي سودآور و پرمنفعت، پرورش قارچ خوراكي نتوانسته جايگاه واقعي خود را پيدا كند علاوه بر اين بيتوجهي مراكز تحقيقات كشاورزي موجب عدم تربيت نيروي متخصص لازم و كافي براي پرورش و توليد قارچ خوراكي شده است. دلايل عمده عملكرد پايين قارچ خوراكي تكمهاي سفيد در ايران: 1ـ عدم تهيه يك بستر كشت مناسب تهيه و آمادهسازي بستر كشت، (كمپوست) از مهمترين مراحل پرورش قارچ خوراكي است، زيرا تغذيه قارچ خوراكي از بستر كشت تأمين ميشود و قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، يك تجزيه كننده ثانويه ميباشد و از اجساد ميكروارگانيسمهاي موجود در كمپوست نيز استفاده ميكند.2ـ عدم رعايت بهداشت محيط 3ـ عدم كنترل دقيق شرايط محيطي، در زمان پرورش قارچ4ـ ضعف بنيه نژادي استفاده پياپي و تكثير رويشي اسپاون با همان روشهاي قديمي، منجر به ضعيف شدن قدرت رويشي اسپاون و كاهش شديد عملكرد آن، شده است. اسپاون وارداتي با زير كشتهاي متوالي، ضعيف ميشود. همچنين ممكن است اسپاون وارداتي نامرغوب باشد، لذا توليد اسپاون مرغوب در داخل كشور، امري ضروري است. در همين راستا از حدود هفت سال پيش، تحقيقات در زمينه توليد اسپاون هيبريد، در دانشكده كشاورزي (گروه بيوتكنولوژي) دانشگاه فردوسي مشهد، آغاز شده است.تاريخچه پرورش قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: كشت قارچ تكمهاي سفيد، در قرن هفدهم ميلادي در حومه پاريس بوسيله باغبانان فرانسوي در هواي آزاد، صورت گرفت، با كشف اين نكته، كه وجود نور براي رشد اين قارچ، ضروري نيست و در تاريكي هم ميتوانند رشد نمايند. در اوايل قرن نوزدهم كشت و پرورش قارچ، در غارهاي طبيعي، معادن و تونلهاي حفر شده در فرانسه، توسعه زيادي پيدا كرد. كشت و پرورش قارچ، در اوايل نيمه دوم قرن 19 از اروپا به ايالات متحده امريكا سرايت كرد و در سال 1890، مزرعهداران ايالت پنسيلوانياي امريكا، به پرورش قارچ در فضاهاي سرپوشيده اشتغال ورزيدند. اين كار به سرعت در ساير مناطق رايج شده و متعاقب آن سالنهاي ويژهاي براي پرورش قارچ خوراكي احداث شد (سينگر و هريس، 1987) [1].با گسترش علم زيستشناسي و اختراع و پيشرفت ميكروسكوپ و روشهاي ميكروبيولوژيكي كاشت و پرورش قارچهاي خوراكي، توجه دانشمندان به اين موضوع بيشتر جلب شد. در سال 1884 دانشمنداني از جمله مارچوت و كنستانتين، موفق به توليد اسپاون استريل، توسط جوانه زني توده اسپورهاي اين قارچ، در شرايط آزمايشگاهي شدند. در سال 1905 داگر موفق به تهيه اسپاون قارچ تكمهاي گرديد و مطالعات خود را براي تهيه بذر خالص قارچ، از كشت بافت منتشر كرد و بدين ترتيب اولين گام در اصلاح قارچ تكمهاي، برداشته شد. از سال 1910 به بعد، كشت و توليد اين قارچ در گلخانه و محيطهاي كنترل شده رواج پيدا كرد. در سال 1920، كشاورزان اروپايي، به علت تغيير وسائل نقليه از اسب به ماشين، به فكر تهيه كمپوست از منابع جديد، (كاه و كلش و كود مرغ) به جاي كمپوست اسبي افتادند. لامبرت از ايالات متحده امريكا، اساس تكنولوژي نوين امروزي پرورش قارچ خوراكي را، بنيان نهاد. وي در سال 1932 تهيه بذر قارچ بر روي غلات را ابداع نمود (لامبرت، 1932). انقلاب صنعتي كه سيندر طي سالهاي 1938 تا 1946 در تهيه كمپوست مصنوعي، براي صنعت پرورش قارچهاي خوراكي بوجود آورد، در واقع، دومين قدم در اصلاح اين قارچ بوده است (سيندر، 1938)[2]. بنا به گزارش پاتاك و همكاران، از دهه 1960، توسعه توليد و پرورش قارچ خوراكي بويژه تكمهاي سفيد، به شيوة مدرن، در اكثر كشورها، بويژه در ايالات متحده امريكا آغاز گرديد (پاتاك و همكاران، 1960)[3]. در اواخر دهه 1970 و اوايل دهه 1980 فريش، طي يك برنامه اصلاحي بلندمدت، موفق به گزينش و معرفي نژادهاي U1 و U3 گرديد، كه نقطه عطفي در اصلاح قارچ مذكور است (فريش، 1983)[4].در ايران، از سال 1376 نخستين گامهاي اصلاحي، براي بهبود نژادي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، در دانشكده كشاورزي مشهد برداشته شده است. طي سالهاي 79ـ1377 نخستين فرايند اصلاحي با بهينهسازي شرايط كشت تك اسپور، آغاز شد (گردان، 1379). در سالهاي 82ـ1380 با بهينه سازي شناخت هموكاريونها، با استفاده از نشانگر ملكولي RAPD گامي مؤثر، در جهت تسريع فرايند اصلاحي قارچ تكمهاي سفيد، برداشته شد (كاووسي، 1382).در سالهاي 83ـ1381 شاخصههاي اصلاحي بر عملكرد قارچ خوراكي تكهاي سفيد، مورد بررسي قرار گرفت (خاتمي، 1383). در اين تحقيق كه از سال 1382 آغاز شده است، به بررسي قابليت تركيب پذيري عمومي و خصوصي در ده ايزوله خالص هموكاريون پرداخته شده است، تا در نهايت بتوانيم بهترين ايزوله هموكاريون براي تركيب با ساير هموكاريونها را بشناسيم و همچنين، از بين تمامي تلاقيهاي دو به دو بدست آمده، بهترين دورگ با بيشترين عملكرد را، معرفي كنيم. اميد است، نتايج حاصل از اين تحقيق گامي در جهت پيشبرد اصلاح اين قارچ، باشد. آشنايي اجمالي با قارچ خوراكي تكمهاي سفيد:قارچ خوراكي تكمهاي سفيد با نام علمي Agaricus bisporus و نام انگليسي The White Button Mushroom شناخته ميشود.طبقهبندي:كليه موجوداتي كه قارچ ناميده ميشوند، در سه سلسله جداگانه قرار ميگيرند (جان و همكاران، 1996)[5].1ـ سلسله Fungi 2ـ سلسله Stramenopila 3ـ سلسله Protistaقارچ خوراكي تكمهاي سفيد، يك قارچ عالي، متعلق به سلسله Fungi است.رده بندي:سلسله: Fungi شاخه: Basidiomycotaرده: Hymenomyceteراسته: Agaricaleخانواده: Agaricaceaجنس: Agaricusگونه:Bisporus قارچها، فاقد كلروفيل هستند و براي بقاء خود، متكي به وجود مواد آلي هستند، يعني به اصطلاح، هترو تروف[6] ميباشند.چنانچه مواد آلي مورد نياز قارچها فقط از گياهان مرده جذب گردد، به آنها، گندرو[7] ميگويند. قارچ خوراكي تكمهاي سفيد فقط از بقاياي گياهان تغذيه ميكند، بنابراين يك قارچ گندرو ميباشد (جان و همكاران، 1996)[8].اصطلاح Mushroom به اندام گوشتي توليد كننده اسپور قارچها، اطلاق ميشود و ميتوان گفت كه ماشرومها خوراكي[9] يا سمي[10] هستند. در شاخه Basidiomycota قارچهاي خوراكي جنس Agaricus، Pleurotus، VolvariellaوLentinus بيشتر مورد توجه هستند. اندام شناسي قارچ خوراكي تكمهاي سفيد: اصطلاح تكمهاي از شكل ظاهري اين قارچ در هنگام جواني، گرفته شده است. هرچند كه اين مرحله ناپايدار است و قارچ در مرحله بلوغ، به حالتي چتري در ميآيد. به طور كلي يك قارچ خوراكي تكمهاي سفيد، از دو قسمت عمده تشكيل شده است. قسمت چتري كه به صورت كلاهك[11] پهن است و قسمت دوم، پايه[12] كه كلاهك را نگه ميدارد (گوپتا، 1988)[13]. پايه قارچ دو وظيفه را عهدهدار است. اولاً، كاملاً توپر است تا بتواند كلاهك را، محكم نگه دارد. ثانياً، كلاهك قارچ را، از سطح زمين بالا برده، به طوريكه اسپورها شانس مناسبي براي قرارگرفتن در جريان هوا داشته باشند و موقعيت مناسب و مؤثري براي پراكنده شدن اسپورها، ايجاد سازد (اينگلد، 1996)[14].اسپورها بر روي تيغهها قرار دارند و تيغهها در سطح زيرين كلاهك جاي دارند. در هنگام جواني، كلاهك قارچ توسط يك غشاء[15] كه بين كلاهك و پايه تشكيل ميشود پوشيده شده است اين غشاء پس از پاره شدن، اطراف پايه را فرا ميگيرد كه حلقه[16] ناميده ميشود. در قارچA.bisporus، كلاهك به رنگ سفيد، كرم يا قهوهاي رنگ و تقريباً صاف و نرم و در بعضي موارد، داراي پولكهاي كوچك است. سطح كلاهك در اين قارچ، محدب است كه در نهايت كاملاً پهن و گوشتي ميشود. پايه به صورت مركزي، سفيد و استوانهاي و محكم است كه در قسمت تحتاني آن ضخيمتر بوده و به تدريج كه به سمت بالا ميآيد باريكتر ميشود. وسيله تكثير اين قارچ، اسپور است كه در حقيقت، همان بازيديوسپورها[17] هستند. بازيديوسپورها در سطح خارجي تيغههاي[18] كلاهك به صورت يك لايه به نام هيمينيوم[19] تشكيل ميشوند. بازيديومها سلولهايي هستند كه، بازيديوسپورها بر روي آنها قرار دارند (جندرز، 1982)[20] مشخصات پرگنه در كشت خالص: پرگنه يا كلني[21]، تودة ميسليومي رشد يافته است و ميتوان، آن را در محيط كشت غذايي به اشكال مختلف رشتهاي، پنبهاي، نمدي و بدون ميسليوم هوايي مشاهده نمود. ميسليومها ضمن رشد انتهايي، انشعابات متعدد نيز توليد ميكنند، كه مطلوبترين شكل رشد ميسليومها به صورت رشتهاي و داراي ميسليوم هوايي است، كه اين موضوع در عملكرد قارچ حائز اهميت است (لامبرت و همكاران، 1983)[22] مشاهده شده است كه برخي از نژادهاي اين قارچ، پرگنه خاكستري مايل به سفيد و ميسليوم هوايي كمتري توليد ميكنند و گروهي ديگر، ميسليوم هوايي زياد توليد كرده و شكل پنبهاي به خود ميگيرند (كليگمن، 1943)[23] [1]-Singer & Harris, 1987[2]-Sinder, 1938[3]-Pathak et al . 1960[4]-Fritsch, 1983[5]-John et al. 1996[6]-Heterotroph[7]-Saprophyte[8]- John et al. 1996[9]-Edible[10]-Poisonous[11]-Cap[12]-Stipe[13]-Gupta, 1993[14]- Ingold, 1996[15]-veil[16]-Annulus[17]-Basidiospore[18]-Gills[19]-Hymenium[20]-Genders, 1982[21]-Colony[22]-Lambert et al., 1983[23]- Kligman, 1943