مقدمهدرحالحاضرجمعیتجهانبالغبرپنجمیلیاردنفرمیباشد. ازروشهایمختلفیبایدموادغذاییموردنیازآنهارا تامینکرد. باپیشرفتمیکروبشناسیکاربردیاستفادهازمیکروارگانیسمهاوآنزیمهایحاصلازآنهاوسایرمتابولیت هایمیکروبی،بهعنوانروشهاییدرتولیدموادغذاییوبهبودکیفیتوکمیتآنها،درتولیدموادغذاییراهیافتهاند. بنابراینباکنترلوفرآیندکردنروشهاینسبیوبهکارگرفتنمیکروارگانیسمهایشناختهشدهومناسب،میتوانکیفیت وکمیتانواعموادغذاییرابطورقابلملاحظهایافزایشداد.ازآنجملهمیتوانبهاستفادهازآنزیمهایمیکروبیبهمانند پکتیناز،سلولاز،آمیلاز وپروتئازبرایشفافکردنآبمیوهوحذفپکتینوالیافسلولزدرآناستفادهکرد. پکتینازدرسال1930بوسیلهآزمایشهایزیادیکهدرفرآیندتولیدآبمیوهوشرابانجامشد،کشفگردید.درطولسال 1960اطلاعاتوسیعیازشیمیگیاهانبدستآمدکهکاربردموثرآنزیمهارانشانمیداد،کهازآنجملهآنزیمپکتینازبود .آبمیوه،مایعاستخراجشدهازسلولهایمیوههایرسیدهمیباشد. درهرنوعمیوهرسیدهسهنوعقندمختلف،بنامهای فروکتوز،گلوکزوساکارزوجوددارد.همچنیندرانواعمیوهها،اسیدهایآلیمختلف،ازجملهاسیدسیتریک،اسیدمالیکو اسیدتارتاریکبههمراهانواعویتامینهاوموادمعدنیوجوددارند. اینترکیباتدرمیوههابهآنهاخصوصیاتشیرینیوترشیرامیدهند.آبمیوههاییکهباکیفیتپایینورنگتیره،دربازارعرضهمیشوند،اگرچهازعمرطولانیوقیمت پایینبرخوردارند،بااینوجودموردپسندمشتریانواقعنمیشوند.بنابراینتولیدکنندگانآبمیوه،بایدبهکیفیتآبمیوه توجهداشتهباشند. یکیازمراحلمهمدرفرآیندتولیدآبمیوهها،بخصوصآبمیوهسیبمرحلهآنزیمزنیاست. مرحله آنزیمزنیازاهمیتخاصیبرخورداراست،چونباحذفاینمرحلهدرفرآیند،باعثتولیدآبمیوهکدرخواهدشد.امروزهدراکثرنقاطدنیا،آبمیوهبصورتشفافشدهتهیهوتولیدمیشود. آنزیم ها، در واقع، کاتالیزورهای زیستی با ماهیت پروتئینی هستند و توسط موجودات زنده حیوان، گیاه و میکروارگانیسم تولید می شوند. انجام تمامی واکنش ها در سلول زنده به آنزیم نیازمند است. نقش عمده آنزیم ها در موجودات زنده، کاتالیزور واکنش های تجزیه و ترکیب است. آنزیم ها موجب افزایش سرعت واکنش های زیستی می شوند و در معرض تغییرات فیزیکی و شیمیایی قرار می گیرند.فعالیت کاتالیزوری آنزیم ها معلول ساختمان خاص پروتئینی آنها است و عمل کاتالیزوری آنها در جای مشخصی از آنزیم به نام جایگاه فعال یا جایگاه کاتالیزوری انجام می شود.همان طور که اشاره شد، آنزیم ها را می توان از منابع مختلف حیوانی، گیاهی و میکروبی تهیه کرد. آنزیم های تجارتی در سه گروه زیر طبقه بندی می شوند:1- آنزیمهای صنعتی، مانند آمیلازها، پروتئازها، گلوکز ایزومراز، لیپاز، کاتالاز، پنیسیلین آمیلاز و آنزیم های پکتیکی2- آنزیمها آنالیتیکی، مانند گلوکز اکسیداز، گالاکتوز اکسیداز، الکل دهیدروژناز، هگزوکیناز،مورامیداز و کلسترول اکسیداز3- آنزیم های پزشکی، مانند آسپراژیناز، پروتئاز، لیپاز و استرپتوکینازآنزیم ها از دیدگاه انواع واکنش هایی که توسط آنها کاتالیز می شوند، به 6 دسته تقسیم شده اند:دسته اول، گروه اکسیدوردوکتازها: این آنزیم ها کاتالیزور واکنش های اکسایشی- کاهشی هستند و عبارتند از دهیدروژنازها، اکسیدازها و پروکسیدازهادسته دوم، گروه ترانسفرازها: این آنزیم ها در واکنش هایی که در آنها گروههای شیمیایی انتقال می یابد، به عنوان کاتالیزور عمل می کنند. در این گروه می توان از کینازها که گروه فسفات را از ATP به جسم دیگر منتقل می سازند و ترانس امینازها که انتقال گروه آمینی را به عهده دارند، نام برد.دسته سوم،گروه هیدرولازها: این آنزیم ها کاتالیزورهای واکنش های آبکافت هستند و عبارتند از: آنزیم های پکتیکی، لیپازها و آمیلازها.دسته چهارم، گروه لیازها: این آنزیم ها گروههای بخصوصی را بدون انجام عمل آبکافت حذف می کنند و تشکیل پیوند دوگانه می دهند. از این گروه می توان دکربوکسیلازها و آلدولازها را ذکر کرد.دسته پنجم، ایزومرازها: این آنزیم ها، کاتالیزور واکنش جابجایی داخلی بر روی یک ماده اولیه هستند. از این گروه می توان ایزومرهای سیس- ترانس، اپی مرازها و راسمازها را ذکر کرد.در این واکنش ها ATP به عنوان دهنده انرژی توسط لیگازها آبکافت، وAMP و پیرو فسفات ایجاد خواهد شد.پکتينازها (Pectinase) آنزيمهایی هستند که معمولاّ با روش ميکروبي، بعنوان يک محصول برون سلولي توسط ميکروارگانيسم هاي مولد آن توليد مي شوند.عموماانزیم پکتيناز به سه روش تخمير غوطه ور[1] ، تخمير حالت جامد[2] و کشت سطحي[3] توليد مي گردد. تخمير حالت جامد به علت مزاياي زيادي که در مقايسه با دو روش ديگر دارد مورد توجه محققان مي باشد. کشت سطحي نيز داراي مزايايي است که خود را از دو روش ديگر متمايز مي سازد. مهم ترين مزاياي اين روش عبارتند از: کم بودن هزينه و انرژي مورد نياز، در پايان تخمير مي توان مايع زير توده ميکروبي را کشيده و با محيط کشت جديد جايگزين نمود، به اين ترتيب با حفظ قارچها از سيکل قبلي دوره متوسط تخمير در سيکل جديد کاهش مي يابد، نياز به هوادهي داخل محيط کشت و هم زدن ندارد.مطالعات بسياري به توليد پکتيناز به روش تخمير غوطه ور يا حالت جامد يا کشت سطحي با استفاده از قارچ آسپرژيلوس نايجر اختصاص داده شده است. مهمترين مزيت استفاده از قارچ آسپرژيلوس نايجر کاربرد آسان آن و قابليت تخمير طيف گسترده اي از مواد خام ارزان قيمت و راندمان بالاي توليد مي باشد.فصل اول این پایان نامه به مبانی و کلیات نظری و مرور پژوهش های گذشته اختصاص دارد. در فصل دوم روش های استخراج و تخلیص آنزیم آورده شده است. در فصل سوم مواد و روش های اندازه گیری به کار برده شده در این تحقیق توضیح داده شده است. در فصل چهارم نتایج ارائه و تحلیل شده است. در فصل پنجم مدلی برای تولید مداوم پلی گالاکتورونازها آورده شده و در فصل ششم نتیجه گیری نهایی و پیشنهاداتی برای ادامه پژوهش ارائه گردیده است. فصل اولکلیات و مبانی نظری 1-1- پکتینازهاپکتینازها[4] گروه بزرگی از آنزیم ها هستند که پلی ساکاریدهای گیاهی را به مولکولهای ساده تر مثل گالاکتورونیک اسید می شکنند.این عمل موجب افزایش بازده و شفاف سازی آب میوه جات می شود. از آنجه که مواد پکتیکی گروهای مولکولی پیچیده ای هستند آنزیمهای پکتینو لیتیکی مختلفی نیاز است تا بتوانند آنها را به صورت کامل بشکنند. تولید پکتیناز 10% از کل تولید آنزیم ها را به خود اختصاص داده است.آنزیم های پکتینولیتیکی به صورت گسترده در صنایع غذایی برای تولید آبمیوه و دیگر نوشیدنیها استفاده می شوند. این بخش آنزیم پکتینولیتیکی و سوبستراهای آنها، تولید میکروبی پکتیناز و عوامل مؤثر بر آن و همچنین کاربردهای صنعتی این آنزیم ها را شرح می دهد.1-2- سوبسترای پکتیکیسوبستراهای پکتیکی مولکولهای گلوکوزیدی پیچیده با جرم مولکولی بالا هستند که در کشت ها پیدا میشوند. آنها در دیواره ابتدایی سلولی حضور دارند و اجزاء اصلی لامای میانی هستند، یک لایۀ چسبنده بین دیواره ها و سلولهای جوان نزدیک تشکیل می دهند.در مدت کوتاهی، آنها باعث شکل گیری ساختار و پیوستگی بافت های گیاه می شوند. سه گروه اصلی پلی ساکاریدهای پکتیکی ساخته شده اند که همگی دارای دی- گالاکتورونیک اسید هستند. 1-2-1- هوموگالاکتورونان(HG)یک پلیمر خطی است که به وسیلۀ دی- گالاکتورونیک اسید که می تواند استیله یا متیل استری شدهباشد، تشکیل می شود. این قسمت می تواند قسمت صاف پکتین نام بگیرد. مولکول بر حسب سطح استری شدن آن دسته بندی می شود: پکتینی که حداقل 75% گروههای کربوکسیل آن متیله شده باشند؛ اسپکتینی که کمتر از 75% گروه کربوکسیل متیله دارد؛ اسید پکتیک یا پلی گالاکتورونیک اسید که گروه کربوکسیلی متیل استری شده ندارد. کلمه پکتین معمولاً برای تمام مواد پکتیکی به کار برده می شود.1-2-2- رامنو گالاکتورونان (RGI)RGI از تکرار دی ساکاریدرامنوز گالاکتورونیک اسید بوجود آمده است. باقیمانده های گالاکتورونی میتوانند استیله شده و هر دو گروه باقیمانده می توانند زنجیره های جانبی قند را به مثل گالاکتوز، آرابینوزو زایلوز جدا کنند.1-2-3- رامنو گالاکتورونان (RGΠ)بر خلاف اسم آن RGΠیک زنجیرۀ هوموگالاکتورونان است. که دارای زنجیره های جانبی پیچیده که به باقیمانده های گالاکتورونیک متصل هستند، می باشد.ویکن و همکاران یک ساختار برای پکتین پیشنهاد دادند که در این مدل HG و RGII زنجیره های جانبی طویل برای RGI می باشند. شکل(1-1) هر دو زنجیرۀ RG منطقه کرکی مولکول نامیده می شوند. در میوجات نارس، پکتین به صورت ماده پکتیکی نامحلول در آب یعنی پرتوپکتین یافت می شود. پکتین با فیبرهای سلولز پیوند برقرار می کند و به صورت صلب روی دیوارۀ سلول در می آید. در هنگام رسیدن میوه ساختار پکتین را با شکاندن زنجیرۀ اصلی یا زنجیره های فرعی دگرگون می کنند که نتیجۀ آن ایجاد مولکولهای قابل حل بیشتر می باشد. مواد پکتیکی تمایل به تشکیل ساختار ژل مانند دارند این تمایل هنگامی روی می دهد که بخش های HG تشکیل یک شبکه کریستالی سه بعدی داده باشند که آب و مواد محلول در فواصل شبکه جایگزین شوند. فاکتورهای متعددی مانند دما، نوع پکتین، درجۀ استری شدن، درجه استالی شدن، pH، قند و دیگر حل شونده ها و خصوصاً تداخل بین یونهای کلسیم و گروههای کربوکسیل استری نشده پکتین خصوصیات ژلی پکتین را تعیین می کنند. در پکتین با درجه استری شدن بالا، مناطق اتصال بوسیلۀ اتصال جانبی HG توسط پیوند هیدروژنی و نیروهای هایدروفوبیک بین گروههای متوکسی که هر دو توسط غلظت بالای قند و pH پایین تقویت می شوند تشکیل می شوند.1-3- آنزیم های پکتینولیتیکی پکتینازها گروهی از آنزیم ها هستند که شکستن مواد پکتیکی را هنگام واکنش های شکستن پلیمرآنها (هیدرولیز) یا دی استری شدن کاتالیز می کنند. شکل 1-1 : ساختار پایه ای پکتین شمای کلی ساختار معمولی (A) و ساختار جایگزین پیشنهادی(B)شناخته شده ترین آنزیم های پکتینولیتیکی آنزیم های شکنندۀ هوموگالاکتورونان هستند. شکل(1-3) شکل عمل آنزیم پکتیناز را نشان می دهد.1-3-1- پرتو پکتینازهاپرتو پکتینازها پکتین نامحلول را به صورت پلیمر قابل حل در می آورند آنها به دو دسته تقسیم میشوند: یکی آنهایی که با منطقۀ پلی گالاکتورونیک اسید از پرتو پکتین واکنش می دهند که نوع A نامیده می شود و دیگری آنهایی که با زنجیرۀ پلی ساکارید که زنجیرۀ پلی گالاکتورونیک اسید را به دیوارۀ سلول متصل می کند، واکنش می دهنداین گروه نوع B نامیده می شوند.1-3-2- پکتین متیل استراز(PME)پکتین متیل استراز ، دی استری شدن گروه متوکسی پکتین را که اسید پکتیک و متانول تولید می کند، کاتالیز می کند. این آنزیم به صورت گزینشی روی گروه متیل استری واحد گالاکتورنات تا یک گروه غیر استری واحد گالاکتورونات عمل می کند.این آنزیم قبل از پلی گالاکتوروناز و پکتات لیاز عمل می کند و نیاز به سوبسترای غیر استری دارد . این آنزیم در گروه کربوهیدارات استراز طبقه بندی می شود.1-3-3- پکتین استیل استرازپکتین استیل استراز، استیل استر پکتین که تولید کتیک اسید و استات می کند را هیدرولیز می کند. این آنزیم در گروه خانوادۀ 12و 13 کربوهیدرات استراز طبقه بندی می شود.1-3-4- پلی متیل گالاکتوروناز(PMG)پلی متیل گالاکتوروناز شکستن هیدرولیتیکی پیوند آلفا1- و4 گلوکوزیدی را زنجیرۀ اصلی پکتین کاتالیز میکند. این عمی خصوصاً بر روی پکتین L درجۀ استری بالا صورت گرفته و تولید 6- متیل گالاکتورونات می کند.1-3-5- پلی گالاکتورونازهاپلی گالاکتورونازها هیدرولیز اتصالات آلفا 1و 4 گلوکوزیدی در پلی گالاکتورونیک اسید که تولید محلول دی گالاکتورونات می کند را کاتالیز می کند. این آنزیم در خانواده 28 گلیکوسیل هیدرولاز قرار دارد. هر دو گروه آنزیم های هیدرولاز (PMG,PG)می توانند در دو حالت exo و endo عمل کنند.endo-PG و endo-PMG عمل شکستن سوبسترا را به صورت تصادفی، کاتالیز می کنند. اما exo-PGشکستن هیدرولیتی بر روی سوبسترا در پایان زنجیره عمل می کنند و مونوگالاکتورونات یا دی گالاکتورونات تولید می کنند. هیدرولازها معمولاً توسط قارچ تولید می شوند و در محیط خنثی یا اسیدی فعالیت بیشتری از خود نشان می دهند، جدول(1-1). شکل 1-2 : تداخل یونهای بین گروههای استری نشدۀ باقیماندۀ گالاکتورونوسیل از دو زنجیرۀHG شکل 1-3 : شکل عمل پکتیناز1-4- کاربردهای صنعتی پکتینازپکتینازهای اسیدی که در صنایع آب میوه استفاده می شوند از منابع قارچی خصوصاً آسپرژیلوس نایجر تهیه می شوند.1-4-1- استخراج آب میوه جاتپکتین بوسیلۀ بالا بدون تیرگی ویسکوزیته در هنگام استخراج و فیلتراسیون و شفاف سازی آب میوه جات ممکن است در این صنایع مسئله ساز شود.در مورد شفاف سازی آب میوه جات (سیب ،گلابی و انگور) آین آنزیم ها برای افزایش بازده آبگیری از میوه به کار می روند. ترکیبی از پکتیناز و سلولز بازدهی بالای 100% را نتیجه می دهد آنزیم های پکتیکی از قارچ که معمولاً ، آسپرژیلوس نایجر، پنی سیلیوم و وترتیس سیزی می باشند ، تولید می شوند.مخلوطی از پکتیناز و آمیلاز برای شفاف سازی به کار می رود.این کار زمان فیلتراسیون را به نصف کاهش می دهد. تزریق پکتینازها کاربرد صنعتی برای کندن پوست مرکبات در صنعت آبمیوه گیری دارد. آنزیم پکتیناز با سطح بالای فعالیت پلی گالاکتوروناز جهت رفع تیرگی و تثبیت آبمیوه به آن اضافه می شود.یکی از کاربردهای آنزیم های پلی گالاکتوروناز و شاید مهمترین کاربرد آن در صنایع آب میوه گیری است، که بسیار مورد توجه قرار می گیرد.در طی آبگیری از میوه جات مقداری از پکتین به صورت های محلول ونا محلول در آب میوه ظاهر می شود که این موجب کاهش کیفیت آب میوه و کاهش بازدهی تولید می شود. پلی گالاکتورونازها می توانند کدری ناشی از مواد پکتینی در آب میوه جات را از بین ببرند. این آنزیم ها می توانند بازدهی تولید آب میوه را نیز افزایش دهند یعنی با کاهش گرانروی و از بین بردن کدری آب میوه که به خاطر مواد پکتینی و پرس شدن می باشد موجب بهبود کیفیت آن می شوند. البته در مواقعی که حذف رنگ موجود درآب میوه (که در ثر آبگیری با پوست حاصل شده است) مطرح باشد نیز موثر است. مراحل شفاف سازی آب میوه جات بر حسب نوع میوه و کیفیت محصول مورد نیاز متفاوت است.برای میوه جاتی که مغز آنها قابل استفاده است، عمل آنزیمی آب میوه در دمای20-25 درجه سانتی گراد صورت می گیرد. برای توت و میوه جات حاوی هسته مانند انگور قرمز، رنگ آب میوه نیز مطرح است. در اینجا دمای 50 درجه سانتی گراد و افزودن سلولاز و نگه داری دما در حدود 60-65 درجه سانتی گراد توصیه می شود، زیرا با افزایش دما و افزودن آنزیم، استخراج رنگ از پوست نیز راحت تر است.برای میوه جاتی که مغز آنها قابل استفاده است، عمل آنزیمی آب میوه در دمای20-25 درجه سانتی گراد صورت می گیرد. برای توت و میوه جات حاوی هسته[5] مانند انگور قرمز، رنگ آب میوه نیز مطرح است. 1-SmF2-SSF3-SCF4- Pectinases5- Stone fruit