واژههاي كليدي: پروتئاز، سبوس گندم، تخمیر حالت جامد، بیوراکتور سینیدار، Bacillus. licheniformisفهرست مطالبفصل11مقدمه11-1. مقدمه21-2. تعریف آنزیم21-3. تاریخچه آنزیم21-4. ساختار آنزیم41-5. تقسیمبندی آنزیمها51-6. تاریخچه آنزیم پروتئاز61-7. عملکرد پروتئازها61-8. تخمیرحالت جامد71-9. ضرورت انجام پروژه81-10. اهداف این پروژه8فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي102-1. مقدمه112-2. پروتئازها112-3. منابع پروتئازها122-3-1. پروتئازهای گیاهی122-3-2. پروتئازهای حیوانی132-3-3. پروتئازهای میکروبی132-4. تقسیم بندی پروتئازها162-5. پروتئازهای قلیایی192-6. مکانیزم عمل پروتئازها222-7. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز222-7-1. صنعت مواد شوینده232-7-2. صنایع غذایی242-7-3. صنعت چرم252-7-4. صنعت عکاسی262-7-5. صنایع دارویی262-7-6. مدیریت محیط زیست272-8. تولید آنزیم پروتئاز272-9. تخمیر حالت غوطه ور282-9-1. تخمیر حالت جامد292-9-2. مقایسه سیستمهای تخمیر جامد و غوطهور292-9-3. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد302-9-4. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو312-9-5. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو322-9-6. انتقال اکسیژن322-9-7. نفوذ آنزیمها332-9-8. جنبههای انتقال حرارت342-9-9. میکروارگانیزمهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد352-9-10. کاربردهای تخمیر حالت جامد372-9-11. آنزیمهای بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد382-10. طراحی بیوراکتور392-11. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد402-11-1. بیوراکتورهای سینیدار412-11-2. بیوراکتورهای بسترپرشده 422-11-3. بیوراکتورهای استوانه ایدوار432-11-4. بیوراکتورهای بسترسیال452-12. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور462-13. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور47فصل3 مواد و روشها483-1. مقدمه493-2. تجهیزات مورد استفاده493-3. تعیین مشخصات سوبسترا503-3-1. محاسبه میزان خاکستر503-3-2. محاسبه میزان رطوبت513-3-3. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا513-3-4. محاسبه میزان پروتئین523-3-5. تعیین درصد مواد استخراجی543-3-6. تعیین درصد سلولز543-3-7. تعیین درصد لیگنین553-3-8. تعیین درصد همیسلولز553-3-9. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا553-4. میکروارگانیسم و محیط کشت563-4-1. انتخاب میکروارگانیسم563-4-2. مشخصات میکروارگانیسم573-4-3. محیط کشت573-4-4. تهیه مایه تلقیح593-4-5. منحنی رشد باکتری603-4-6. تعیین pH بهینه باکتری603-5. تخمیر حالت جامد613-6. نمونهگیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیریافته633-7. فعالیت پروتئاز643-7-1. منحنی استاندارد تیروزین653-8. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینیدار663-8-1. تأثیر نوع سوبسترای جامد663-8-2. تأثیر مدت زمان تخمیر673-8-3. اثر دما673-8-4. تأثیر pH673-8-5. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم683-8-6. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا683-8-7. تأثیر رطوبت داخلی راکتور683-8-8. تأثیر اندازه ذرات683-8-9. تأثیر میزان تلقیح693-8-10. تأثیر غنیسازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی693-8-11. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی693-8-12. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی703-9. کاربردهای آنزیم تولیدی713-9-1. افزودنی به مواد شوینده713-9-2. پردازش چرم713-9-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلمهای عکاسی و آزاد سازی نقره723-10. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک72فصل4 نتایج و تفسیر آنها734-1. مقدمه744-2. محاسبه خصوصیات سبوس گندم744-3. منحنی رشد باکتری754-4. pH بهینه رشد باکتری754-5. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز764-5-1. تأثیر مدت زمان تخمیر764-5-2. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد784-5-3. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئاز794-5-4. تأثیر pH ابتدایی824-5-5. بررسی دمای داخل بیوراکتور824-5-6. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا844-5-7. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور854-5-8. تأثیر اندازه ذرات864-5-9. تاثیر میزان مایه تلقیح874-5-10. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی874-6. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم924-6-1. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم924-6-2. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم944-6-3. تعیین pH پایداری آنزیم954-6-4. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم964-7. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis974-7-1. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده974-7-2. موزدایی از پوست984-7-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلمهای X-Ray994-8. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک100فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها1035-1. نتیجهگیری1045-2. پیشنهادها106 فهرست اشکالفصل11قدمه1شکل1-1. مکانیزم اثر آنزیم بر روی انرژی واکنش3شکل1-2. شماتیکی از مدلهای ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی4شکل1-3. نقش پروتئازها در کاتالیز کردن پیوندهای پپتیدی7فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي10شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد32شکل2-2. بیوراکتور سینیدار42شکل2-3. بیوراکتور بسترپرشده بصورت افقی و عمودی43شکل2-4. بیوراکتور استوانه ایدوار44شکل2-5. بیوراکتور بسترسیال45فصل3 مواد و روشها48شکل3-1. منحنی استاندارد گلوکز52شکل3-2. منحنی استاندارد پروتئین53شکل3-3. تصویر میکروسکوپی از باکتری B. licheniformis56شکل3-4. نمایی از بیوراکتور مور استفاده جهت تولید پروتئاز در تخمیر حالت جامد62شکل3-5. دیاگرام شماتیک بیوراکتور سینیدار. (1) پمپ، (2) نمایشگر و کنترلر دما و رطوبت، (3) نازل (4) المنت حرارتی، (5) سینی، (6) فن، (7) حسگر دما، (8) حسگر رطوبت63شکل3-6. نمونه 5گرمی سوبسترای تخمیریافته، (1) : قبل از تخمیر، (2): پس از تخمیر64شکل3-7. منحنی استاندارد تیروزین66فصل4 نتایج و تفسیر آنها73شکل4-1. منحنی رشد باکتری75شکل4-2. تأثیر زمان تخمیر بر روی فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis77شکل4-3. تأثیر زمان تخمیر بر روی محتوای پروتئین کل78شکل4-4. تأثیر نوع سوبسترای جامد بر فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis79شکل4-5. تأثیر محلول های مختلف بر استخراج پروتئاز تولیدی از B.licheniformis80شکل4-6. تأثیر حجم بافر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis81شکل4-7. تأثیر زمان اقامت در شیکر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis81شکل4-8. اثر pH ابتدایی بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis82شکل4-9. تأثیر دمای داخل بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis83شکل4-10. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis84شکل4-11. اثر رطوبت داخلی بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis85شکل4-12. تأثیر اندازه ذرات سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis86شکل4-13. تأثیر میزان مایه تلقیح بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis87شکل4-14. تأثیر منابع کربنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis89شکل4-15. تأثیر غلظت های مختلف سبوس برنج بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis89شکل4-16. تأثیر منابع نیتروژنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis91شکل4-17. تأثیر غلظت های مختلف آرد ذرت بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis91شکل4-18. تأثیر pH بر فعالیت آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis93شکل4-19. اثر دما بر فعالیت آنزیم پروتئاز94شکل4-20. اثر pH بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis95شکل4-21. اثر دما بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis96شکل4-22. اثر زمان بر پایداری حرارتی آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis97شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis بعنوان افزودنی به شوینده، (1) کنترل، (2) اثر شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده، (3) اثر آنزیم و شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده98شکل4-24. موزدایی آنزیمی از پوست گاو با استفاده از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis (1) کنترل (2) نمونه پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق98شکل4-25. هیدرولیز آنزیمی لایه ژلاتینی با استفاده از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis.. (1) کنترل،(2) فیلم عکاسی پس از هیدرولیز آنزیمی99شکل4-26. تأثیر زمان بر تولیدآنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک101شکل4-27. تأثیر دما بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک101شکل4-28. تأثیر رطوبت ابتدایی بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک102شکل4-29. تأثیر محرکهای پروتئینی مختلف بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک102فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها103 فهرست جداولفصل11مقدمه1جدول1-1. گروههای آنزیمی و واکنشهای مرتبط5فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي10جدول2-1. پروتئازهای قلیایی باکتریایی تجاری، شرکت تولید کننده، منابع و کاربردهای صنعتی 15جدول2-2. برخی از خواص کارلسبرگ و BPN19جدول2-3. دمای بهینه و پایداری حرارتی پروتئازهای قلیایی حاصل از گونه های باسیلوس20جدول2-4. pH بهینه پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط گونه باسیلوس21جدول2-5. میکروارگانیسمهای مورد استفاده در فرآیندهای تخیمری حالت جامد36جدول2-6. کاربردهای تخمیر حالت جامد37جدول2-7. آنزیمهای تولید شده در فرآیند تخمیر حالت جامد38جدول2-8. انواع بیوراکتورها در فرآیند تخمیر جامد و محصولات تولیدی46فصل3 مواد و روشها48جدول3-1. ترکیب محیط کشت مایع58جدول3-2. ترکیبات مایه تلقیح60فصل4 نتایج و تفسیر آنها73جدول4-1. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سبوس گندم74جدول4-2. pH بهینه رشد باکتری76جدول4-3. تأثیر سبوس برنج (1%) و آرد ذرت (2%) بر تولید پروتئاز در بیواکتور سینی دار92فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها103 فهرست علائم اختصاريدور بر دقیقه ........................................................................................................................................rpm مولار ............................................................................................................................................................... Mمیلی لیتر ........................................................................................................................................................ mlمیلی گرم ....................................................................................................................................................... mg فصل1 مقدمه 1-1. مقدمهدر این فصل به بیان توضیحاتی کلی درباره آنزیم ها، ساختار و ویژگیهایشان پرداخته میشود. سپس گروههای آنزیمی و واکنشهای مرتبط بیان میشود. در ادامه مطالبی اجمالی درباره پروتئازها به عنوان یکی از مهمترین گروههای آنزیمی ذکر میشود. سپس فرآیند تخمیر حالت جامد بعنوان یک سیستم تخمیری کارآمد معرفی میشود. در انتها به ضرورت ها و اهداف این پروژه پرداخته میشود.1-2. تعریف آنزیمآنزیمها، مهمترین گروه از پروتئینها هستند که انجام واکنشهای بیوشیمیایی و سرعت بخشیدن به آنها را بر عهده دارند و میتوانند سرعت واکنش را تا حدود 107 برابر افزایش دهند. آنزیمها، توسط موجودات زنده، گیاهان و میکروارگانیسمها تولید میشوند. انجام تمام واکنشها در سلول زنده به آنزیم خاصی نیازمند است. همانطور که در شکل (1-1) نشان داده شده است، آنزیم مانند یک کاتالیزور غیرآلی در واکنش مصرف نشده اما مسیر انرژی پایینتر را برای اینکه واکنش صورت گیرد، فراهم میکند [1, 2]. کاتالیزورها در واکنشها بدون تغییر میمانند، ولی آنزیمها مانند سایر پروتئینها تحت شرایط مختلف پایدار نمیمانند. برخی از آنزیمها عمدتا در بازه محدودی از pH، دما و قدرت یونی فعال هستند و در دما و pHهای بالاتر از میزان بهینه، آنزیم تخریب شده و فعالیت خود را ازدست میدهد [3, 4]. به دلیل شرایط خاص بسیاری از این آنزیمها ، برای مصارف صنعتی پیشنهاد نمیشوند، لذا تلاش جهت یافتن گونههای جدیدی که جوابگوی نیاز صنعت باشند، یک فرآیند مستمر میباشد [5].1-3. تاریخچه آنزیمفعالیت کاتالیستی آنزیمها، هزاران سال است که در فرآیندهای مختلف مانند ساخت پنیر، شراب و نانوایی مورد استفاده قرارگرفتهاست [6]. تا قرن نوزدهم مشخص شده بود كه فرايندهايي نظير ترش شدن شير و تخمير قند به الكل فقط از طريق عمل يك موجود زنده رخ ميدهند. در سال 1833 عامل فعالكننده قند به طور نسبي خالص شد و آن را دياستاز[1] ناميدند كه اكنون به آن آميلاز[2] ميگويند. چند سال بعد از شيره معده فردي كه رژيم غذايي اوپروتئين بود ، مادهاي جدا كردند و آن را پپسين[3] ناميدند. اين تركيبات را تحت نام كلي مخمر ميناميدند. ليبيگ[4] در آن موقع اظهارداشت كه اين مخمرها مي توانند مواد غير زندهاي باشند كه از سلولهاي زنده به دست ميآيند در حاليكه پاستور [5] و ديگران هنوز بر اين باور بودند كه مخمرها بايستي حاوي مواد زنده باشند. با وجود اين اختلاف نظرها ، كوهن[6] در سال 1878، این مولکولها را آنزيم نامید. بوخنرز[7] در سال 1897 نشان داد كه وقتي عصاره مخمر به قند اضافه شود، تخمير قند صورت ميگيرد. درسال 1926 سامنر[8] آنزيم اوره آز[9] را ازعصاره لوبيا خالصكرد و آن را كريستاله نمود. از آن به بعد تعداد زيادي از آنزيمها را توانستند به شكل بلور درآورند [7, 8]. همزمان با بوجود آمدن دانش خالصسازی آنزیمها، موارد کاربرد آنها چندین برابر شد و البته با استفاده از آنزیمهای مهندسی شده، تعداد انتخابها برای فرآیندهای صنعتی افزایش یافت [6].
تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینیدار با استفاده از فرآیند تخمیر حالت جامد WORD
واژههاي كليدي: پروتئاز، سبوس گندم، تخمیر حالت جامد، بیوراکتور سینیدار، Bacillus. licheniformisفهرست مطالبفصل11مقدمه11-1. مقدمه21-2. تعریف آنزیم21-3. تاریخچه آنزیم21-4. ساختار آنزیم41-5. تقسیمبندی آنزیمها51-6. تاریخچه آنزیم پروتئاز61-7. عملکرد پروتئازها61-8. تخمیرحالت جامد71-9. ضرورت انجام پروژه81-10. اهداف این پروژه8فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي102-1. مقدمه112-2. پروتئازها112-3. منابع پروتئازها122-3-1. پروتئازهای گیاهی122-3-2. پروتئازهای حیوانی132-3-3. پروتئازهای میکروبی132-4. تقسیم بندی پروتئازها162-5. پروتئازهای قلیایی192-6. مکانیزم عمل پروتئازها222-7. کاربردهای صنعتی آنزیم پروتئاز222-7-1. صنعت مواد شوینده232-7-2. صنایع غذایی242-7-3. صنعت چرم252-7-4. صنعت عکاسی262-7-5. صنایع دارویی262-7-6. مدیریت محیط زیست272-8. تولید آنزیم پروتئاز272-9. تخمیر حالت غوطه ور282-9-1. تخمیر حالت جامد292-9-2. مقایسه سیستمهای تخمیر جامد و غوطهور292-9-3. انتقال جرم در تخمیر حالت جامد302-9-4. عملیات انتقال جرم در مقیاس ماکرو312-9-5. عملیات انتقال جرم در مقیاس میکرو322-9-6. انتقال اکسیژن322-9-7. نفوذ آنزیمها332-9-8. جنبههای انتقال حرارت342-9-9. میکروارگانیزمهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد352-9-10. کاربردهای تخمیر حالت جامد372-9-11. آنزیمهای بدست آمده از فرآیند تخمیر جامد382-10. طراحی بیوراکتور392-11. انواع بیوراکتورهای مورد استفاده در تخمیر حالت جامد402-11-1. بیوراکتورهای سینیدار412-11-2. بیوراکتورهای بسترپرشده 422-11-3. بیوراکتورهای استوانه ایدوار432-11-4. بیوراکتورهای بسترسیال452-12. مراحل عمومی برای انجام فرآیند SSF در داخل بیوراکتور462-13. عوامل مؤثر در تولید پروتئاز در فرآیند SSF در داخل بیوارکتور47فصل3 مواد و روشها483-1. مقدمه493-2. تجهیزات مورد استفاده493-3. تعیین مشخصات سوبسترا503-3-1. محاسبه میزان خاکستر503-3-2. محاسبه میزان رطوبت513-3-3. محاسبه میزان قند موجود در سوبسترا513-3-4. محاسبه میزان پروتئین523-3-5. تعیین درصد مواد استخراجی543-3-6. تعیین درصد سلولز543-3-7. تعیین درصد لیگنین553-3-8. تعیین درصد همیسلولز553-3-9. محاسبه اندازه ذرات سوبسترا553-4. میکروارگانیسم و محیط کشت563-4-1. انتخاب میکروارگانیسم563-4-2. مشخصات میکروارگانیسم573-4-3. محیط کشت573-4-4. تهیه مایه تلقیح593-4-5. منحنی رشد باکتری603-4-6. تعیین pH بهینه باکتری603-5. تخمیر حالت جامد613-6. نمونهگیری و استخراج آنزیم از سوبسترای تخمیریافته633-7. فعالیت پروتئاز643-7-1. منحنی استاندارد تیروزین653-8. بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر روی تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور سینیدار663-8-1. تأثیر نوع سوبسترای جامد663-8-2. تأثیر مدت زمان تخمیر673-8-3. اثر دما673-8-4. تأثیر pH673-8-5. اثر پارامترهای مختلف بر روی استخراج آنزیم683-8-6. تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا683-8-7. تأثیر رطوبت داخلی راکتور683-8-8. تأثیر اندازه ذرات683-8-9. تأثیر میزان تلقیح693-8-10. تأثیر غنیسازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی693-8-11. تأثیر pH بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی693-8-12. تأثیر دما بر فعالیت و پایداری آنزیم تولیدی703-9. کاربردهای آنزیم تولیدی713-9-1. افزودنی به مواد شوینده713-9-2. پردازش چرم713-9-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلمهای عکاسی و آزاد سازی نقره723-10. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک72فصل4 نتایج و تفسیر آنها734-1. مقدمه744-2. محاسبه خصوصیات سبوس گندم744-3. منحنی رشد باکتری754-4. pH بهینه رشد باکتری754-5. بررسی پارامترهای مختلف بر تولید پروتئاز764-5-1. تأثیر مدت زمان تخمیر764-5-2. بررسی تأثیر نوع سوبسترای جامد784-5-3. بررسی پارامترهای مؤثر بر استخراج پروتئاز794-5-4. تأثیر pH ابتدایی824-5-5. بررسی دمای داخل بیوراکتور824-5-6. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا844-5-7. تأثیر رطوبت داخلی بیوراکتور854-5-8. تأثیر اندازه ذرات864-5-9. تاثیر میزان مایه تلقیح874-5-10. بررسی تأثیر غنی سازی سوبسترا با منابع کربنی و نیتروژنی874-6. بهینه سازی شرایط فعالیت پروتئازی آنزیم924-6-1. تعیین pH بهینه فعالیت آنزیم924-6-2. تعیین دمای بهینه فعالیت آنزیم944-6-3. تعیین pH پایداری آنزیم954-6-4. تعیین دمای بهینه پایداری آنزیم964-7. کاربردهای آنزیم پروتئاز قلیایی حاصل از B.licheniformis974-7-1. عملکرد پروتئاز قلیایی به عنوان افزدونی به شوینده974-7-2. موزدایی از پوست984-7-3. هیدرولیز لایه ژلاتینی فیلمهای X-Ray994-8. مقایسه تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک100فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها1035-1. نتیجهگیری1045-2. پیشنهادها106 فهرست اشکالفصل11قدمه1شکل1-1. مکانیزم اثر آنزیم بر روی انرژی واکنش3شکل1-2. شماتیکی از مدلهای ارائه شده برای جایگاه فعال آنزیمی، (1): مدل قفل و کلید، (2): مدل القایی4شکل1-3. نقش پروتئازها در کاتالیز کردن پیوندهای پپتیدی7فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي10شکل2-1. ارتباط فرآیندهای میکرو و ماکرو در فرآیند تخمیر حالت جامد32شکل2-2. بیوراکتور سینیدار42شکل2-3. بیوراکتور بسترپرشده بصورت افقی و عمودی43شکل2-4. بیوراکتور استوانه ایدوار44شکل2-5. بیوراکتور بسترسیال45فصل3 مواد و روشها48شکل3-1. منحنی استاندارد گلوکز52شکل3-2. منحنی استاندارد پروتئین53شکل3-3. تصویر میکروسکوپی از باکتری B. licheniformis56شکل3-4. نمایی از بیوراکتور مور استفاده جهت تولید پروتئاز در تخمیر حالت جامد62شکل3-5. دیاگرام شماتیک بیوراکتور سینیدار. (1) پمپ، (2) نمایشگر و کنترلر دما و رطوبت، (3) نازل (4) المنت حرارتی، (5) سینی، (6) فن، (7) حسگر دما، (8) حسگر رطوبت63شکل3-6. نمونه 5گرمی سوبسترای تخمیریافته، (1) : قبل از تخمیر، (2): پس از تخمیر64شکل3-7. منحنی استاندارد تیروزین66فصل4 نتایج و تفسیر آنها73شکل4-1. منحنی رشد باکتری75شکل4-2. تأثیر زمان تخمیر بر روی فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis77شکل4-3. تأثیر زمان تخمیر بر روی محتوای پروتئین کل78شکل4-4. تأثیر نوع سوبسترای جامد بر فعالیت پروتئاز تولیدی از B.licheniformis79شکل4-5. تأثیر محلول های مختلف بر استخراج پروتئاز تولیدی از B.licheniformis80شکل4-6. تأثیر حجم بافر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis81شکل4-7. تأثیر زمان اقامت در شیکر بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis81شکل4-8. اثر pH ابتدایی بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis82شکل4-9. تأثیر دمای داخل بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis83شکل4-10. تأثیر رطوبت ابتدایی سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis84شکل4-11. اثر رطوبت داخلی بیوراکتور بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis85شکل4-12. تأثیر اندازه ذرات سوبسترا بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis86شکل4-13. تأثیر میزان مایه تلقیح بر فعالیت و پروتئین کلی پروتئاز تولیدی از B.licheniformis87شکل4-14. تأثیر منابع کربنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis89شکل4-15. تأثیر غلظت های مختلف سبوس برنج بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis89شکل4-16. تأثیر منابع نیتروژنی مکمل بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis91شکل4-17. تأثیر غلظت های مختلف آرد ذرت بر تولید آنزیم پروتئاز تولیدی از B.licheniformis91شکل4-18. تأثیر pH بر فعالیت آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis93شکل4-19. اثر دما بر فعالیت آنزیم پروتئاز94شکل4-20. اثر pH بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis95شکل4-21. اثر دما بر پایداری آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis96شکل4-22. اثر زمان بر پایداری حرارتی آنزیم پروتئاز پروتئاز تولیدی از B.licheniformis97شکل4-23. عملکرد پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis بعنوان افزودنی به شوینده، (1) کنترل، (2) اثر شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده، (3) اثر آنزیم و شوینده تجاری بر روی پارچه لکه شده98شکل4-24. موزدایی آنزیمی از پوست گاو با استفاده از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis (1) کنترل (2) نمونه پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای اتاق98شکل4-25. هیدرولیز آنزیمی لایه ژلاتینی با استفاده از پروتئاز قلیایی تولیدی از B.licheniformis.. (1) کنترل،(2) فیلم عکاسی پس از هیدرولیز آنزیمی99شکل4-26. تأثیر زمان بر تولیدآنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک101شکل4-27. تأثیر دما بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک101شکل4-28. تأثیر رطوبت ابتدایی بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک102شکل4-29. تأثیر محرکهای پروتئینی مختلف بر تولید آنزیم پروتئاز در بیوراکتور و فلاسک102فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها103 فهرست جداولفصل11مقدمه1جدول1-1. گروههای آنزیمی و واکنشهای مرتبط5فصل2 مروري بر منابع مطالعاتي10جدول2-1. پروتئازهای قلیایی باکتریایی تجاری، شرکت تولید کننده، منابع و کاربردهای صنعتی 15جدول2-2. برخی از خواص کارلسبرگ و BPN19جدول2-3. دمای بهینه و پایداری حرارتی پروتئازهای قلیایی حاصل از گونه های باسیلوس20جدول2-4. pH بهینه پروتئازهای قلیایی تولید شده توسط گونه باسیلوس21جدول2-5. میکروارگانیسمهای مورد استفاده در فرآیندهای تخیمری حالت جامد36جدول2-6. کاربردهای تخمیر حالت جامد37جدول2-7. آنزیمهای تولید شده در فرآیند تخمیر حالت جامد38جدول2-8. انواع بیوراکتورها در فرآیند تخمیر جامد و محصولات تولیدی46فصل3 مواد و روشها48جدول3-1. ترکیب محیط کشت مایع58جدول3-2. ترکیبات مایه تلقیح60فصل4 نتایج و تفسیر آنها73جدول4-1. خصوصیات فیزیکی و شیمیایی سبوس گندم74جدول4-2. pH بهینه رشد باکتری76جدول4-3. تأثیر سبوس برنج (1%) و آرد ذرت (2%) بر تولید پروتئاز در بیواکتور سینی دار92فصل5 نتیجهگیری و پیشنهادها103 فهرست علائم اختصاريدور بر دقیقه ........................................................................................................................................rpm مولار ............................................................................................................................................................... Mمیلی لیتر ........................................................................................................................................................ mlمیلی گرم ....................................................................................................................................................... mg فصل1 مقدمه 1-1. مقدمهدر این فصل به بیان توضیحاتی کلی درباره آنزیم ها، ساختار و ویژگیهایشان پرداخته میشود. سپس گروههای آنزیمی و واکنشهای مرتبط بیان میشود. در ادامه مطالبی اجمالی درباره پروتئازها به عنوان یکی از مهمترین گروههای آنزیمی ذکر میشود. سپس فرآیند تخمیر حالت جامد بعنوان یک سیستم تخمیری کارآمد معرفی میشود. در انتها به ضرورت ها و اهداف این پروژه پرداخته میشود.1-2. تعریف آنزیمآنزیمها، مهمترین گروه از پروتئینها هستند که انجام واکنشهای بیوشیمیایی و سرعت بخشیدن به آنها را بر عهده دارند و میتوانند سرعت واکنش را تا حدود 107 برابر افزایش دهند. آنزیمها، توسط موجودات زنده، گیاهان و میکروارگانیسمها تولید میشوند. انجام تمام واکنشها در سلول زنده به آنزیم خاصی نیازمند است. همانطور که در شکل (1-1) نشان داده شده است، آنزیم مانند یک کاتالیزور غیرآلی در واکنش مصرف نشده اما مسیر انرژی پایینتر را برای اینکه واکنش صورت گیرد، فراهم میکند [1, 2]. کاتالیزورها در واکنشها بدون تغییر میمانند، ولی آنزیمها مانند سایر پروتئینها تحت شرایط مختلف پایدار نمیمانند. برخی از آنزیمها عمدتا در بازه محدودی از pH، دما و قدرت یونی فعال هستند و در دما و pHهای بالاتر از میزان بهینه، آنزیم تخریب شده و فعالیت خود را ازدست میدهد [3, 4]. به دلیل شرایط خاص بسیاری از این آنزیمها ، برای مصارف صنعتی پیشنهاد نمیشوند، لذا تلاش جهت یافتن گونههای جدیدی که جوابگوی نیاز صنعت باشند، یک فرآیند مستمر میباشد [5].1-3. تاریخچه آنزیمفعالیت کاتالیستی آنزیمها، هزاران سال است که در فرآیندهای مختلف مانند ساخت پنیر، شراب و نانوایی مورد استفاده قرارگرفتهاست [6]. تا قرن نوزدهم مشخص شده بود كه فرايندهايي نظير ترش شدن شير و تخمير قند به الكل فقط از طريق عمل يك موجود زنده رخ ميدهند. در سال 1833 عامل فعالكننده قند به طور نسبي خالص شد و آن را دياستاز[1] ناميدند كه اكنون به آن آميلاز[2] ميگويند. چند سال بعد از شيره معده فردي كه رژيم غذايي اوپروتئين بود ، مادهاي جدا كردند و آن را پپسين[3] ناميدند. اين تركيبات را تحت نام كلي مخمر ميناميدند. ليبيگ[4] در آن موقع اظهارداشت كه اين مخمرها مي توانند مواد غير زندهاي باشند كه از سلولهاي زنده به دست ميآيند در حاليكه پاستور [5] و ديگران هنوز بر اين باور بودند كه مخمرها بايستي حاوي مواد زنده باشند. با وجود اين اختلاف نظرها ، كوهن[6] در سال 1878، این مولکولها را آنزيم نامید. بوخنرز[7] در سال 1897 نشان داد كه وقتي عصاره مخمر به قند اضافه شود، تخمير قند صورت ميگيرد. درسال 1926 سامنر[8] آنزيم اوره آز[9] را ازعصاره لوبيا خالصكرد و آن را كريستاله نمود. از آن به بعد تعداد زيادي از آنزيمها را توانستند به شكل بلور درآورند [7, 8]. همزمان با بوجود آمدن دانش خالصسازی آنزیمها، موارد کاربرد آنها چندین برابر شد و البته با استفاده از آنزیمهای مهندسی شده، تعداد انتخابها برای فرآیندهای صنعتی افزایش یافت [6].