واژه‌های کلیدی: قارچ رایزوپوس اوریزا- آنزیم لیپاز- لوفا- استر 1- بوتیل اولئات- بهینه سازی شرایط واکنشفصل اول11 مقدمه2فصل دوم7مروری بر مفاهیم و مطالعات انجام شده72 پیش گفتار82.1 آنزیم..82.2 تاریخچه آنزیم92.3 آنزیم لیپاز102.4 تفاوت آنزیم لیپاز و کربوکسیل استراز112.5 علل افزایش توجه محققان به آنزیم لیپاز112.6 واکنش‌های آنزیم لیپاز122.7 ویژگی‌های آنزیم لیپاز142.7.1 خاصیت ساختاری (حضور درپوش بر جایگاه فعال)142.7.2 فعال سازی سطحی152.7.3 گزینش پذیری سوبسترا162.7.4 مقاومت در برابر افزایش دما و تغییرات(pH)192.8 تولید آنزیم لیپاز202.8.1 منابع تولید آنزیم لیپاز202.8.2 مقایسه لیپازهای باکتریایی و قارچی و کاربردهای آن‌ها222.8.3 لیپازهای قارچ‌های رشته‌ای232.8.4 جداسازی آنزیم‌ها242.8.5 رشد میکروارگانیسم و القا آنزیم262.9 تثبیت سلولی272.9.1 مقایسه مزایا و معایب تثبیت آنزیم و سلول272.9.2 کاربری آنزیم یا سلول تثبیت یافته292.9.3 روش‌های تثبیت سلول302.9.4 انتخاب نگاه‌دارنده و روش به منظور تثبیت سلولی362.9.5 مکانیسم تراوشی و جایگاه لیپاز در سلولی قارچ رایزوپوس اوریزا و اثر تثبیت بر تراوش آن422.10روش‌های سنجش فعالیت آنزیم لیپاز452.10.1 روش‌های سنجش فعالیت آبکافت آنزیم لیپاز452.10.2 روش‌های سنجش فعالیت سنتزی آنزیم لیپاز462.11کاربردهای آنزیم لیپاز472.12واکنش‌های سنتز استر492.12.1 پارامترهای موثر بر پیشرفت واکنش سنتز استر512.12.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات54فصل سوم62مواد و روش‌ها623 پیش گفتار633.1 مواد شیمیایی633.2 وسایل و دستگاه‌های مورد استفاده643.3 میکروارگانیسم653.4 شرح انجام آزمایش‌ها663.4.1 کشت جامد میکروارگانیسم663.4.2 تولید محلول اسپور قارچ663.4.3 کشت مایع میکروارگانیسم683.5 تهیه بیوکاتالیست سلولی683.5.1 اسفنج لوفا به عنوان نگاه‌دارنده سلولی683.5.2 تثبیت قارچ رایزوپوس اوریزا و تهیه بیوکاتالیست683.5.3 تعیین میزان آب بیوکاتالیست سلولی703.6 رسم منحنی رشد میکروارگانیسم رایزوپوس اوریزا به فرم آزاد703.7 فعال سازی غربال‌های مولکولی713.8 روش کدورت سنجی سنجش اسیدهای چرب آزاد713.8.1 تهیه محلول معرف استات مس- پیریدین723.8.2 رسم منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد جهت سنجش فعالیت استریفیکاسیون723.9 سنجش فعالیت ویژه آنزیم733.9.1 فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)-تولید استر743.9.2 فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی(بیوکاتالیست سلولی)753.10واکنش سنتز استر 1-بوتیل اولئات753.10.1 آنالیز جهت تعیین پیشرفت واکنش763.10.2 آنالیز محصول تولیدی به روش کروماتوگرافی گازی- اسپکتروسکپی جرمی763.11انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال773.11.1 سنتز استر 1- بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان773.11.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات در عدم حضور حلال783.11.3 مقایسه اثر محدودیت‌های انتقال جرمی درون قطعه لوفا، بر سرعت اولیه واکنش در حضور حلال و عدم حضور حلال.............783.12بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان813.12.1 بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش813.12.2 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی813.12.3 سوبسترای اسیدی823.12.4 بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش823.12.1 بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش833.12.2 بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی83فصل چهارم84نتایج و تحلیل ها844 پیش گفتار854.1 منحنی رشد رایزوپوس اوریزا854.2 بررسی و مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته864.2.1 فعالیت آبکافتی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)864.2.2 فعالیت سنتزی سیستم آنزیمی (بیوکاتالیست سلولی)- تولید استر884.3 انتخاب سیستم واکنشی سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور و عدم حضور حلال894.3.1 سنتز استر 1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان894.3.2 سنتز استر 1-بوتیل اولئات در عدم حضور حلال914.3.3 مقایسه پارامتر انتقال جرم درونی قطعه لوفا در حضور و عدم حضور حلال924.4 بهینه سازی شرایط واکنش سنتز استر1-بوتیل اولئات در حضور حلال هگزان974.4.1 بررسی اثر نسبت مولی حلال به سوبسترا بر بازدهی و سرعت واکنش974.4.2 بررسی اثر غلظت کاتالیست بر بازدهی و سرعت اولیه واکنش994.4.3 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا الکلی1004.4.4 بررسی اثر افزایش غلظت سوبسترا اسیدی1014.4.5 بررسی اثر حذف آب بر بازده واکنش1034.4.6 بررسی تغییرات بازده در استفاده پی‌درپی از بیوکاتالیست سلولی105نتیجه‌گیری و پیشنهادات1075 پیش‌گفتار1085.1 نتیجه‌گیری1085.2 پیشنهادات جهت مطالعات آتی1115.2.1 بیوکاتالیست1115.2.2 بستر واکنش1125.2.3 شرایط واکنش1125.2.4 محصول113منابع و مراجع114پیوست114 شکل 2‑1- اثر کاتالیست بر انرژی مورد نیاز جهت آغاز واکنش8شکل 2‑2- نمایش جایگاه فعال آنزیم و نحوه انجام واکنش کاتالیستی9شکل 2‑3-جایگاه آنزیم لیپاز بر اساس طبقه بندی (IUBMB)10شکل 2‑4- شماتیک واکنش تعادلی هدرولیز(از سمت چپ) استریفیکاسیون (از سمت راست) در حضور لیپاز13شکل 2‑5 -ساختارفضایی از نمای بالا آنزیم لیپاز گونه Mucor meihei را نمایش می دهد که با تغییر قطبیت مناطق مختلف رنگ آمیزی شده است(آبی تیره-آبی کم رنگ-سفید-قرمز-قرمز تیره). ترکیبات کربنی و سولفور گستره غیر قطبی و ترکیبات نیتروژنی و اکسیژنی سبب ایجاد بخش های قطبی می شوند. درشکل 2-با افزایش قطبیت در اطراف جایگاه فعال درپوش کنار رفته و جایگاه فعال(رنگ زرد) قابل دسترس است[18].16شکل 2‑6-شماتیکی از عملکرد آنزیم های غیرگزینشی مکانی[19].17شکل 2‑7- دیاگرام روش‌های جداسازی آنزیم برون سلولی و درون سلولی از سلول و محیط کشت[25]25شکل 2‑8- دسته بندی روش‌های تثبیت سلولی[37].30شکل 2‑9-نمایی از تثبیت به روش جذب سطحی[36]31شکل 2‑10-تثبیت به روش کوالانسی[36]32شکل 2‑11-به دام انداختن در شبکه متخلخل [36]33شکل 2‑12- کپسوله کردن سلول ها34شکل 2‑13- روش تثبیت با استفاده از اتصالات جانبی[36]34شکل 2‑14- تجمع طبیعی سلول ها[36]35شکل 2‑15 –شکل سمت چپ گیاه لوفا،شکل وسط میوه خشک شده گیاه،شکل سمت راست نمای داخلی لوفا[41]40شکل 2‑16-شکل1- قطعه کامل لوفا؛2-مقطع عرضی لوفا،3- ساختار میکرونی لوفا در cm1؛ 4-مقطع عرضی لوفا در مقیاس mm0/1؛ 5-مقطع عرضی در مقیاس mm0/01 در شکل 4و5 تغیرات خواص فزیکی لوفا قابل مشاهده است[42].41شکل 2‑17-شماتیکی از موقعیت ایزوآنزیم های لیپاز در سلول رایزوپوس اوریزا و مکانیسم ترشح لیپاز به خارج از سلول[5]43شکل 2‑18- شکل A - تولید لیپاز در کشت سلول به فرم آزاد ، شکل B به فرم تثبیت یافته[5].44شکل 2‑19-شماتیک ژن کامل لیپاز و شکست آن به ژن آنزیم31 ROL و34 ROL [5].44شکل 2‑20- واکنش کندانسیشن اسید و الکل در حضور کاتالیست اسیدی و یا آنزیمی49شکل 2‑21- استر 1-بوتیل اولئات54شکل 2‑22-شماتیک نقطه ابری لحظه تشکیل کریستال های جامد57شکل 2‑23-نقطه گرفتگی فیلتر ضخیم شدن و تجمع کریستال های جامد58شکل 2‑24- نقطه ریزش ایجاد کریستال های فشرده و تشکیل ژل58شکل 2‑25- حضور روان ساز در ترکیب پلیمری سبب بهبود انعطاف پذیری آن می شود[78].60شکل 2‑26- شماتیک از حضور مولکول روان ساز در ترکیب پلیمری61شکل 3‑1- تصویر سمت چپ شماتیک قارچ رایزپوس اوریزا با بزرگ نمایی اسپور های جنسی و غیر جنسی [80]. شکل سمت راست تصویر تهیه شده توسط میکروسکپ دوربین دار در مقیاس 400X از اسپور میکروارگانسم رایزپوس اوریزا پس از کشت هفت روز.65شکل 3‑2-تصویر 1- کشت اسلنت 7 روزه پوشیده از اسپور تصویر 2- سطح جامد 7 روزه پوشیده از اسپورهای سیاه رنگ تهیه شده در مقیاس 100 X توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-466شکل 3‑3- دیاگرام روش شمارش اسپور با استفاده از لام نئوبار[82]67شکل 3‑4- تصویر 1- محلول اسپور رقیق شده قارچ رایزوپوس اوریزا-تصویر 2- شمارش محلول اسپور توسط لام نئوبار (تصاویر توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-4 در مقیاس1000X تهیه شده است(.67شکل 3‑5-قطعاتلوفا1/5cm بریده شده به فرم دیسکی68شکل 3‑6-تصویر1-سمت چپ قطعه لوفا دیسکی،وسط بیوکاتالیست سلولی تثبیت یافته قبل از خشک شدن (مورفولوژی پلتی قابل مشاهده است)،سمت راست بیوکاتالیست سلولی پس از خشک شدن- تصویر 2-شبکه سلولزی لوفا قبل از فرایند تثبیت سلول –تصویر 3- شبکه سلولزی لوفا پس از تثبیت سلول(تصاویر 2و3 تصاویر توسط میکروسکپ دوربین دار Laboval-4 در مقیاس32X تهیه شده است)69شکل 3‑7-کشت 120 ساعت رایزوپوس اوریزا70شکل 3‑8- غربال مولکولی 3Aبا دانه های 2mm71شکل 3‑9-تصویرسمت راست محلول استات مس پیریدین-تصویر وسط کمپلکس اسید چرب آزاد با محلول معرف- تصویر سمت چب رنگ سبز حاصل شده از حضور اسیدهای چرب در محلول آلی در مقابل عدم حضور اسید چرب در محلول(بی رنگ)72شکل 3‑10- طیف رنگی حاصل از ترکیب اولئیک اسید با استات مس-پیریدین73شکل 3‑11- منحنی استاندارد جذب اسید چرب آزاد به روش مرجع[52]73شکل 4‑1 منحنی رشد قارچ رایزوپوس اوریزا در دمای30 °C و دور150 rpm تلقیح یافته توسط محلول اسپور (spore/mL) 108×5 در محیط کشت پایه قارچ86شکل 4‑2- مقایسه فعالیت آبکافت درون سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد سلول قارچی رایزوپوس اوریزا87شکل 4‑3- مقایسه فعالیت آبکافت خارج سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد سلول قارچی رایزوپوس87شکل 4‑4-مقایسه فعالیت سنتز درون سلولی فرم تثبیت یافته و آزاد قارچ رایزوپوس اوریزا89شکل 4‑5 بازده و سرعت واکنش سنتز استر در برابر پیشرفت زمان در غلظت0/3Mو دمای 37°C دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا90شکل 4‑6 بررسی سرعت و بازده واکنش در عدم حضور حلال 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور یک قطعه لوفا در دمای 50°C - منحنی داخلی مقایسه بازده واکنش در حضور و عدم حضور حلال91شکل 4‑7 سرعت اولیه واکنش و بازده بر حسب دمای واکنش در سیستم بدون حلال در حضور 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور یک عدد لوفا94شکل 4‑8-سرعت اولیه واکنش سنتز استر در برابر دما در غلظت0/3Mو دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا95شکل 4‑9 بررسی اثر افزایش سرعت چرخش بر سرعت اولیه واکنش در عدم حضور حلال در سیستم بدون حلال در حضور 3mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول در حضور 1 عدد لوفا96شکل 4‑10 بررسی سرعت چرخش محلول بر سرعت اولیه واکنش حلال در حضور 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، در دمای37 °C در حضور دو لوفا.97شکل 4‑11 سرعت اولیه واکنش بر حسب تغیررات مولی سوبسترا به حلال-منحنی داخلی درصد بازده نهای بر حسب تغییرات مولی سوبسترا به حلال؛ در محلول 10mL هگزان نسبت 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول ،98شکل 4‑12- بررسی اثر افزایش غلظت کاتالیست(تعداد لوفا) بر سرعت اولیه و(منحنی داخل) واکنش و بازده واکنش دمای 37°C دور 250 rpm در حضور دو قطعه لوفا100شکل 4‑13 بررسی اثر افزایش غلظت 1-بوتانول در اولئیک اسید ثابت بر سرعت اولیه واکنش و بر باززده نهایی واکنش(منحنی داخلی) در 10ml حلال ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا101شکل 4‑14 بررسی اثر افزایش غلظت اولئیک اسید در مقدار ثابت 1-بوتانول ،بر سرعت اولیه واکنش و بازده نهایی(منحنی داخلی) در 10ml حلال، ا-بوتانول 0/3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا102شکل 4‑15- بررسی اثر اضافه کردن جاذب بر بازده واکنش در حضور حلال با نسبت 1:1 سوبسترا103شکل 4‑16-اثر وزن غربال ملکولی بر بازده واکنش در حضور حلال محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0/3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا104شکل 4‑17 - اثر افزودن مرحله ای غربال ملکولی بر بازده واکنش در حضور حلال،محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا و 1/5 g غربال ملکولی-علامت فلش نشان دهنده مراحل اضافه کردن غربال ملکولی را نشان می دهد.105شکل 4‑18-بررسی تغییرات نسبی بازده نهایی واکنش در استفاده پی در‌پی از بیوکاتالیست سلولی محلول واکنش حاوی 10mL محلول 1:1 اولئیک اسید و 1-بوتانول 0.3M ، 250rpm در دمای 37 °C در حضور دو لوفا و 1/5 g غربال ملکولی106جدول 2‑1-مقایسه خواص آنزیم لیپاز و استراز[14]11جدول 2‑2- مزایا و معایب روش‌های تثبیت[38]36جدول 2‑3 - نکات قابل ملاحظه در انتخاب نگاه دارنده[37]36جدول 2‑4- خواص فیزیکی برخی از پایه‌های نگه دارنده استفاده شده جهت تثبیت سلول[39]39جدول 2‑5- جدول 2‑6-کاربردهای صنعتی آنزیم لیپاز به تفکیک نوع صنعت[18]48جدول 3‑1- مواد شیمیایی مورد استفاده در آزمایش‌ها63جدول 3‑2- مشخصات میکروارگانیسم65جدول 4‑1- مقایسه فعالیت بیوکاتالیست سلولی به فرم آزاد و تثبیت یافته88جدول 4‑2- مقایسه ضریب تاثیر انتقال جرم در حضور حلال و عدم حضور حلال92 علائم لاتینRWMTسرعت واکنش در حضور محدودیت‌های انتقال جرمیRWOMTسرعت واکنش در عدم حضور محدودیت‌های انتقال جرمیpHاسیدیتهMمولارmolمولrpmدور بر دقیقهhrساعتminدقیقهsثانیهLلیترmbarمیلی بارcmسانتی مترmmمیلی مترnmنانومترAآنگسترومgگرمmgمیلی گرمUواحد فعالیت آنزیم˚Cدرجه سلسیوسعلائم یونانیµمیکروɳضریب تاثیر انتقال جرمزیرنویسهاWMTدر حضور محدودیت‌های انتقال جرمیWOMTدر عدم حضور محدودیت‌های انتقال جرمی علائم اختصاری ECEnzyme CommisionPVCpolyvinyl chlorideDNADeoxyriboNucleic AcidPsiPounds per square inchUUnitSerSerineHisHistidineGluGlutamic acidAspAspartic acidCPCloud PointPPPour PointCFPPCold Filter Plugging pointLTFTLow Temprature Flow TestCNCetane NumberASTMAmerican Society for Testing and MaterialsEMCEnzyme Modified CheeseRWMTRate With Mass TransfearRWOMTRate Without Mass TransfearPSIPositional Specifity IndexIUBMBInternational Union of Biochemistry and Molecular BiologyGC/MassGass Chromotography/Mass SpectroscopyGCGass ChromotographyTLCThin Layer ChromotographyHPLCHigh performance Liquid ChromotographyImCImmobilized CellFrCFree CellFFAFree Fatty Acid 1 مقدمهامروزه یکی از بزرگ‌ترین چالش‌های بشری تغییرات آب و هوایی زمین و آلودگی محیط زیست ناشی از فعالیت‌های صنعتی است. رها کردن مواد شیمیایی خطرناک و فلزات سنگین ناشی از پساب کارخانه‌های شیمیایی سبب تغییر اکوسیستم می‌شود.شیمی سبز[1] و نیز توسعه پایدار[2] نظریاتی را پیشنهاد می‌کند که گرایش به آن‌ها تولید محصولات خطرناک و سمی را کاهش می‌دهد و یا کاملاً حذف می‌نماید و در نتیجه سبب تولید کم‌تر ضایعات و مصرف بهینه انرژی می‌شود.استفاده از ابزارهای مدرن از جمله علم بیوتکنولوژی در جهت گسترش فرایندهای دوستدار محیط زیست و تولید محصولات زیست شیمایی یکی از راه کارهای گرایش به شیمی سبز و توسعه پایدار است.استفاده بیوکاتالیست‌ها شامل آنزیم‌ها و یا کل سلول(به عنوان منبع آنزیمی و یا سیستم تولیدی آنزیم)جهت دست‌یابی به فرایندهای اقتصادی و دوست دار محیط زیست کاملاً با قوانین شیمی سبز در جهت کاهش آلودگی‌های زیست محیطی هماهنگی دارد.پیشینه استفاده از فرآیندهای آنزیمی را می‌توان در تمدن‌های باستانی بررسی کرد. امروز، نزدیک به 4000 آنزیم شناخته شده است، و از این تعداد، حدود 200 آنزیم در مقیاس تجاری تولید شده‌اند. اکثر آنزیم‌های صنعتی منشأ میکروبی دارند. تا دهه 1960، کل درآمد سالانه فروش آنزیم چند میلیون دلار بود، با افزایش علم در زمینه تولیدات بیو‌شیمیایی، فرآیندهای تخمیری و روش‌های بازیابی، تعداد گسترده‌ای از این آنزیم‌ها به صورت مقرون به صرفه تولیدشده‌اند. بنابراین رشد چشمگیری در بازار آنزیم تجاری مشاهده شد[1].گسترش علم تکنولوژی آنزیم،موفقیت مهمی در صنعت بیوتکنولوژی به شمار می‌آید.بر طبق آمار شرکت نوآزایم[3] «این شرکت در طی سال‌های متوالی% 47 سهم فروش آنزیم‌های صنعتی در سراسر جهان را دارا است و در سال 2012 با رشد% 7 نسبت به سال گذشته، فروش سالانه‌ای، تقریباً معادل با 1/984 میلیارد دلار آمریکا را گزارش کرده است»[2]، این مهم بیان گر اهمیت و کاربرد روز افزون محصولات آنزیمی در سطح جهانی است. سهم عمده‌ای از بازار آنزیم‌های صنعتی متعلق به آنزیم‌های هیدرولیتیک[4] مانند پروتئازها،آمیلازها، آمیدازها، استرازها و لیپازها است.در سال‌های اخیر، لیپاز (تری آسیل گلیسیرول آسیل هیدرولاز، 3.1.1.3EC.) به خواص چند وجهی خود که کارایی‌های گسترده در صنایع مختلف از جمله در صنایع شوینده، مواد غذایی و طعم دهنده، دارویی، آرایشی و بهداشتی، تولید مشتقات استرها و آمینو اسیدها، تولید مواد شیمیایی کشاورزی و پلیمرهای زیستی، تولید محصولات روغنی شیمایی ارزشمند، تفکیک مخلوط‌های راسمیک، ابزارهای تشخیص و سایر کاربردهای پزشکی، صنایع چرم، پارچه و کاغذ سازی، تصفیه فاضلاب و آلاینده‌های نفتی، تولید سوخت زیستی، حسگرهای زیستی و غیره، به عنوان یک آنزیم کلیدی در صنایع بیوتکنولوژی به سرعت در حال پیشرفت است.آنزیم لیپاز عضو طبقه هیدرولازها به شمار می‌رود که در محیط آبی بر روی باندهای کربوکسیلیک استری، حاضر درتری گلیسیریدها، جهت آزاد سازی اسید چرب آزاد و گلیسیرول عمل می‌کنند. سوبسترای طبیعی لیپازها تری گلیسیریدهای زنجیره بلند هستند که حلالیت اندکی در محیط آبی دارند؛بنابراین واکنش در سطح مشترک آب و لیپید رخ می‌دهد در محیط آلی در حضور مقدار اندک آب،لیپازها توانایی یگانه‌ای را در کاتالیز واکنش عکس (واکنش‌های سنتز استر[5] و انتقال گروه‌های آلی از یک الکل، اسید، آمید و یا یک استر به استری دیگر[6]) از خود بروز می‌دهند.بنابراین با وجود عملکرد اختصاصی بالای این آنزیم به علت جایگاه فعال اختصاصی از جهت شیمیایی، فضایی و مکانی دارای گستره وسیعی از سوبستراها می‌باشد[3].