کلمات کلیدی: پلی هیدروکسی آلکانوات، Cupriavidus necator DSMZ 545، کشت غیر پیوسته،کشت نیمه پیوسته،مدل سینتیکی، نانوکامپوزیت بیوپلیمری فهرست مطالبعنوان صفحهمقدمه ...........1فصل اول- مروری بر مطالعات پیشین 1-1-میکروارگانیسمهای تولیدکننده پلیهیدروکسیآلکانواتها .......... 71-2- کوپلیمرهای هیدروکسیآلکانوات .....111-3- نحوه سنتز بیوپلیمرهای هیدروکسیآلکانوات.......141-4- منابع ارزانقیمت کربنی در تولید پلیمرهای PHA ......151-5- سنتز پلیهیدروکسیآلکانواتها در گیاهان.....161-6- اندازهگیری کمی بیوپلیمرها..........181-7- خواص فیزیکی و موارد استفاده پلیمرهای زیستی...... 191-8- قابلیت تجزیهپذیری پلیهیدروکسیآلکانواتها.......211-9- فرایند تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها........................................................................................231-9-1- فرایند غیر پیوسته....................................................................................................................231-9-2- فرایند نیمه پیوسته و پیوسته.......................................................................................................241-10- مدل سینتیکی رشد میکروارگانیسم.............................................................................................281-10-1- بررسی سینتیک رشد در فرایند غیر پیوسته..............................................................................311 -11- تعیین ضریب انتقال اکسیژن دربیوراکتور..................................................................................331-11-1- روشهای اندازه گیری ...................................................................................................33 عنوان صفحه1-12- استفاده پلیهیدروکسیآلکانواتها در صنایع ...............................................................................361-13- کاربرد بیوپلیمر ها در نانوکامپوزیتهای پلیمری..............................................................................391-13-1- انواع نانوکامپوزیتهای پلیمری ................................................................................................391-13-2- روش های ساخت نانوکامپوزیتهای پلیمری .............................................................................41 فصل دوم- مواد و روش ها2-1- میکروارگانیسم..............................................................................................................................452-2- انتقال میکروارگانیسم از حالت یخ خشک به محيط كشت اولیه......................................................472-3- محیط نگهداری............................................................................................................................472-4- محیط کشت تلقیح.......................................................................................................................482-5- محیط کشت تخمیر......................................................................................................................482-6- آماده سازی کشت تلقیح..............................................................................................................492-7- شرایط تخمیر ونمونه برداری........................................................................................................492-8- تهيه منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي- جذب....................................................................502-9- تهيه منحنيهای كاليبراسيون جهت تعيين مقادیر منابع کربن.........................................................512-9-1- طرز تهيه محلول معرف DNS...............................................................................................512-9-2- رسم منحنی كاليبراسيون قندهاي قابل تبديل............................................................................51 عنوان صفحه2-10- شرایط کروماتوگرافگازی برای اندازهگیری پلیهیدروکسیآلکانواتها............................522-10-1- تهیه استاندارد داخلی.......................................................................................................532-10-2- تهیه منحنیهای کالیبراسیون متیلهیدروکسیبوتیرات، متیل هیدروکسیوالراتو متیلهیدروکسیهگزانوات...........................................................................................................532-10-3- استخراج بیوپلیمر و آماده سازی نمونه برای تزریق به دستگاه GC....................................542-10-4- روش شناسائی و تایید بیوپلیمر توسط13C NMR،1H NMR ،. FT-IR................................552-10-4-1- طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) .............................................................................552-10-4-2- طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ......................................................552-11- فرایند بیولوژیکی جهت تولید بیوپلیمر درون سلولی در بیوراکتور.........................................562-11-1- فرایند کشت غیرپیوسته.....................................................................................................562-11-2- فرایندکشت نیمه پیوسته.....................................................................................................562- 11- 2- 1- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت منبع کربن ونیتروژن...........................572- 11- 2- 2- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی متغیر منبع کربن ونیتروژن .........................572-11-3- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور..........................................................................572-12- تولید نانو کامپوزیت پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت.........................................................................................................................59 عنوان صفحهفصل سوم- نتایج و بحث3-1- میکروارگانیسم Hydrogenophaga pseudoflava DSMZ 1034..............................623-1- 1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................623-1-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن................................................................................633-1-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن ...............................................................................653-1-3- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن ...............................................................................663- 2- میکروارگانیسم Cupriavidus necator DSM 545......................................................683-2-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی...........................................................................................683-2-1-2- بررسی تاثیر نسبت نیتروژن به کربن ..................................................................................693-2-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن................................................................................733-2-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................743-2-4- استفاده ازملاس بعنوان تنها منبع کربن...................................................................................753-2-5- تاثیر استات بر رشد میکروارگانیسم و تولید بیوپلیمر..............................................................773-2-5-1 -ترکیب ملاس و استات بعنوان منابع کربن.........................................................................773-3- میکروارگانیسم Azotobacter beijerinckii DSMZ 1041.........................................803-3-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................803-3-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................823-3-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن..............................................................................833-3-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................843-4- میکروارگانیسم Azohydromonas lata DSMZ 1123..............................85عنوان صفحه3-4-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................853-4-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن..............................................................................873-4-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن .............................................................................883-4-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن .............................................................................893-5- نتایج کلی مقایسه چهار میکرو ارگانیسم در تولید بیوپلیمر .......................................................923-6- بررسی سینتیک رشد میکروارگانیسم در تولید بیوپلیمر............................................................923-7- فرایند کشت غیر پیوسته در بیوراکتور.....................................................................................953-7-1- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور ..........................................................................973-8- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت در بیوراکتور.................................................983-9- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی متغیر (پله ای) در بیوراکتور.....................................993-10- بازده بیومس ....................................................................................................................1003-11- بهره دهی .......................................................................................................................1023-12- بازده تولید ......................................................................................................................1033- 13- آزمایشهای تشخیصی جهت تایید بیوپلیمر تولید شده............................................................1053-13-1- طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) ...............................................................................1053-13-2- طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ..........................................................1063-14- بررسی امکان استفاده از بیوپلیمر تولید شده در نانوکامپوزیتها.................................................108 عنوان صفحه فصل چهارم-نتیجه گیری وپیشنهادات4-1- نتیجه گیری..................................................................................................................1134-2- پیشنهادات....................................................................................................................116مراجع ...................................................................................................................................117چکیده انگلیسی ..................................................................................................................127پیوستها.................................................................................................................................128 فهرست شکلهاعنوان صفحهشکل 1-1-شمای ختار کلی پلی هیدروکسی آلکانوآتها.............................................................................8شکل 1-2- ساختار شیمیایی پلیهیدروکسیآلکانواتها ...........................................................................12شکل 1 -3- مسیر بیوسنتز پلیهیدروکسیبوتیرات و پلیهیدروکسیبوتیرات - والرات...............................14شکل1-4- تغییرات موردی یک نمونه از مواد تخریب پذیر زیستی در طول زمان............................................ 22شکل 1-5- شمائی از بیوراکتور استفاده شده جهت فرایند غیر پیوسته و پیوسته........................................ 25شکل 1-6- نمائی از فرایند پیوسته دو مرحله ای........................................................................................26شکل 1-7- مدل های رشد میکروارگانیسم ها..........................................................................................29شکل 2-1- اندازه گیری مستقیم میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت توسط روش دینامیک..............58شکل 3-1- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm ............................................................................................................62شکل 3-2-تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 12 h ................................................................................................................63شکل 3-3- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate =250 rpm ،(seed age = 12..........................................................................................................63شکل 3-4 - بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا.......64شکل 3- 5- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا.....65 عنوان صفحهشکل 3-6 - بیوپلیمر تولیدشده (PHB,PHV) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر...................66شکل 3-7 - تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm.............................................................................................................68شکل 3-8- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی (T = 30°C،(seed age = 24.....................................................................................................................69شکل 3-9- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ، (seed age = 24................................................................................................................. 69شکل 3-10- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 20) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................71شکل 3-11- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 30) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................71شکل 3-12- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز با نسبت کربن به نیتروژن 40 72شکل 3-13- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 50) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................73شکل 3-14- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا....75شکل 3-15-بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ملاس به عنوان سوبسترا......76شکل 3-16- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(35 به 5) به عنوان سوبسترا.................................................................................................................... 77شکل 3-17- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات بانسبت( 30 به10 ) به عنوان سوبسترا..................................................................................................................78 عنوان صفحهشکل 3-18- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(25 به 15) به عنوان سوبسترا......................................................................................... ..........................79شکل 3-19- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(20 به 20) به عنوان سوبسترا..................................................................................................................79شکل 3-20- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 15 ......................................................................................................81شکل 3-21- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =15h...........................................................................81.شکل 3-22- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا ......82شکل 3-23- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا ...83شکل 3-24- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا ....85شکل 3-25- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm.....................................................................................86شکل 3- 26- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age =18 ..........................................................................................................86شکل 3- 27- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =18 ............................................................................87شکل 3-28- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا......88عنوان صفحهشکل 3- 29- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا....89شکل 3- 30- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا ...90شکل 3-31- برازش مدل سینتیکی مونود در فرایند تولید پلی هیدروکسی بوتیرات ...................................94شکل 3- 32- برازش مدل مالتوس بر روی داده های آزمایشگاهی حاصل از فرایند تولید بیوپلیمرتوسط .............................................................................................................................94C. necatorشکل 3-33 - تولید جرم سلولی وپلی هیدروکسی بوتیرات توسط C.necatorدر فرایند غیر پیوسته.......96شکل 3-34 – اندازه گیری میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت بیوراکتور توسط روش دینامیک......97شکل 3-35 - فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک دهی ثابت گلوکز ونیتروژن...98شکل 3-36 - فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک متغیر گلوکز ونیتروژن.........100شکل 3-37- طیف FT- IR از نمونه پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات تولید......................105شکل 3-38- طیف FT- IR از نمونه استاندارد تهیه شده پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات..106شکل 3-39- طیف 1HNMR حاصل از کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات..........107شکل 3-40- طیف 13CNMR حاصل از کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات........108شکل 3- 41- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات...................109شکل 3-42- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت .............................................................................................................................110شکل 3-43- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت تحت اواتراسونیک................................................................................................111 عنوان صفحهشکل پ-1-منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری C. necator.............................................129شكل پ-2- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Hydrogenophaga pseudoflava....129شكل پ-3- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Azotobacter beijerinckii................130شكل پ-4- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Azohydromonas lata .....................130شكل پ-5- منحنی کالیبراسیون گلوکز..................................................................................................131شكل پ-6- منحنی کالیبراسیون فروکتوز................................................................................................131شكل پ- 7- منحنی کالیبراسیون لاکتوز......................................................................................132شكل پ-8- منحنی کالیبراسیون 3- متیلهیدروکسیبوتیرات، 3-متیلهیدروکسیوالرات و3-متیل هیدروکسیهگزانوات................................................................................................................132شکل پ 9- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 200..........................................................133شکل پ 10- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 400........................................................134شکل پ 11- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 600........................................................135شکل پ 12- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 800........................................................136شکل پ 13- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 1000......................................................137شکل پ 14- طیف حاصل از FT-IR بیوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات................138شکل پ 15- طیف C NMR کوپلیمر( پلی 3- هیدروکسی بوتیرات/ 4- هیدروکسی بوتیرات)به دست آمده از فرایند رشدC. necator بر روی روغن نخل.............................................................139شکل پ 16- طیف C NMR بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشدC. necator بر روی سوبستراهای کیک سویا و مخلوط کیک سویا و ملاس....................................140شکل پ 17. طیفهایC NMR وH NMR کوپلیمرPHBV به دست آمده از مخمر نوترکیب........140شکل پ 18 . طیف H NMR بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشدE.coli T.V.N. ..............................................................................................................................141شکل پ 19. طیف H NMR کوپلیمر PHBV به دست آمده از Comamonas sp. EB172 .....141 فهرست جداولعنوان صفحهجدول 1-1- برخی از باکتریهای مورد استفاده در تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها...................................9جدول 1-2- میکروارگانیسمها و منابع مورد استفاده در تولید کوپلیمر هیدروکسیبوتیرات – والرات........13جدول1-3- مقایسه برخی از خواص فیزیکی پلیمرهای تولیدی................................................................19جدول 1-4- برخی از میکروارگانیسمهای جداسازی شده جهت تجزیه PHAs....................................21جدول1-5- تعدادی از متداول ترین مدلهاي رشد غير ساختاري............................................................30جدول 1-6- شرکتهای تولیدکننده پلیمرهای زیستتخریبپذیر..............................................................38جدول 2-1- اجزای محیط کشت تولید (DSMZ, Medium 81) ...................................................46جدول 3- 1- نتایج حاصل از فرایند بیولوژیکی تولید بیوپلیمر توسط میکروارگانیسم ها بر رویمنابع مختلف کربنی................................................................................................................................91جدول 3- 2- مدلهای سینتیکی به کار برده شده برای تولیدپلی هیدروکسی بوتیرات با استفاده از گلوکز..93جدول 3-3- پارامترهای سینتیکی جهت تولید پلی هیدروکسی بوتیرات از منابع کربنی مختلف................95جدول 3-4- حداکثر بازدهی تولید با استفاده از ترکیبات مختلف...........................................................104 مقدمهاستفاده از پليمرها و پلاستيك ها در اغلب وسايل انسان از ريزترين آنها گرفته تا بزرگترين آنها انكار ناپذير است. دليل اين استفاده وافر پليمرها و پلاستيك ها در زندگي انسان خواص بسيار زياد آنها مي باشد. مصرف سرانه پلاستيك در اروپا 60 كيلوگرم و در آمريكا 80 كيلوگرم در سال است [1]. عليرغم فوايد فراوان پليمرها و پلاستيك ها، استفاده از آنها باعث معضلات زيست محيطي فراوان شده است و همين امر باعث شده است كه بشر به فكر توليد پليمرهاي زيست تخريب پذير و تخريب زيستي پليمرها و پلاستيك ها بيافتد.مکانيسمهاي دروني و توانايي خود تنظيمي طبيعت نمي توانند اين آلاينده ها را تجزیه کنند چون با اين مواد نا آشنا هستند. اين امر موجب شده است بسياري از کشورها شروع به توسعه پلاستيک هاي قابل تجزيه زيستي کنند. بر اساس يک تخمين، بيش از 100 ميليون تن پلاستيک هر ساله توليد مي شوند. 40% از اين مقدار به محل هاي دفن زباله منتقل مي شود و چند صد هزار تن هر ساله به محيط هاي دريايي ريخته مي شوند و در مناطق اقيانوسي تجمع مي يابند. سوزاندن پلاستيک ها يکي از گزينه ها در دفع پلاستيک ها مي باشد؛ اما علاوه بر پرهزينه بودن خطرناک نيز مي باشد[1-2].پلاستيک هايي که کاملا تجزيه پذیرند، نسبتاٌ جديد و نويد دهنده اند که به خاطر بهره گیری از باکتريها براي تشکيل بيوپليمر مي باشد که عمدتاٌ شامل پلی هیدروکسی آلکانویت ها[1]، پلی لاکتیک اسیدها[2]، پلی استرهای آلیفاتیک[3]، پلی ساکاریدها[4]، و يا ترکيبي از اين مواد مي باشند[1]. 1- انواع پلیمرهای زیست تخریب پذیرپليمرهاي زيست تخريب پذير زيادي شناسايي شده اند و يكي از مهمترين آنها پلي هيدروكسي آلكانوات ها مي باشد. استفاده از اين گروه پليمرهاي زيست تخريب پذير در كشاورزي و صنايع دارويي و غيره بسيار مورد توجه قرار گرفته است كه دليل آن سازگاري با محيط زيست و سامانه هاي حياتي مي باشد[2].پلي هيدروكسي آلكانوات ها ،پليمرهاي زيست تخريب پذير هستند و به صورت ذرات درون سلولي در ميکروارگانيسم هاي مختلف تشکيل مي شوند[3]. وزن مولکولي اين پليمرها در محدوده 105*2 تا 106*3 دالتون مي باشد. وزن مولکولي بر حسب نوع ميکروارگانيسم و شرايط رشد تغيير مي کند[3].يکي ازمهمترين پلي هيدروکسي آلکانوات ها، پلي هيدروكسي بوتيرات است. پلي هيدروكسي بوتيرات يك پليمر خطي از 3-هيدروكسي بوتيرات است و در اندازه هاي مختلفي از ذرات در داخل سلول موجود است. پلي هيدروكسي بوتيرات به عنوان يك منبع ذخيره انرژي و كربن براي ميكروارگانيزم مي باشد و تحت شرايطي مثل محدوديت نيتروژن، فسفر، اكسيژن، يون ها و غيره در داخل سلول تجمع مي يابد و با رفع اين محدوديت ها پلي هيدروكسي بوتيرات تجزيه مي شود. پلي هيدروكسي بوتيرات جامد به عنوان يك پلي استر ترموپلاستيك زيست تخريب پذير مورد توجه قرار گرفته است زيرا خواص شبيه به خواص تعداد زيادي از پلاستيك هاي سنتزي معمولي دارد[4-6].
تولید بیو پلیمر پلی هیدروکسی آلکانوآتها وبررسی امکان استفاده آنها در نانوکامپوزیتهای پلیمری word
کلمات کلیدی: پلی هیدروکسی آلکانوات، Cupriavidus necator DSMZ 545، کشت غیر پیوسته،کشت نیمه پیوسته،مدل سینتیکی، نانوکامپوزیت بیوپلیمری فهرست مطالبعنوان صفحهمقدمه ...........1فصل اول- مروری بر مطالعات پیشین 1-1-میکروارگانیسمهای تولیدکننده پلیهیدروکسیآلکانواتها .......... 71-2- کوپلیمرهای هیدروکسیآلکانوات .....111-3- نحوه سنتز بیوپلیمرهای هیدروکسیآلکانوات.......141-4- منابع ارزانقیمت کربنی در تولید پلیمرهای PHA ......151-5- سنتز پلیهیدروکسیآلکانواتها در گیاهان.....161-6- اندازهگیری کمی بیوپلیمرها..........181-7- خواص فیزیکی و موارد استفاده پلیمرهای زیستی...... 191-8- قابلیت تجزیهپذیری پلیهیدروکسیآلکانواتها.......211-9- فرایند تولید پلی هیدروکسی آلکانوآتها........................................................................................231-9-1- فرایند غیر پیوسته....................................................................................................................231-9-2- فرایند نیمه پیوسته و پیوسته.......................................................................................................241-10- مدل سینتیکی رشد میکروارگانیسم.............................................................................................281-10-1- بررسی سینتیک رشد در فرایند غیر پیوسته..............................................................................311 -11- تعیین ضریب انتقال اکسیژن دربیوراکتور..................................................................................331-11-1- روشهای اندازه گیری ...................................................................................................33 عنوان صفحه1-12- استفاده پلیهیدروکسیآلکانواتها در صنایع ...............................................................................361-13- کاربرد بیوپلیمر ها در نانوکامپوزیتهای پلیمری..............................................................................391-13-1- انواع نانوکامپوزیتهای پلیمری ................................................................................................391-13-2- روش های ساخت نانوکامپوزیتهای پلیمری .............................................................................41 فصل دوم- مواد و روش ها2-1- میکروارگانیسم..............................................................................................................................452-2- انتقال میکروارگانیسم از حالت یخ خشک به محيط كشت اولیه......................................................472-3- محیط نگهداری............................................................................................................................472-4- محیط کشت تلقیح.......................................................................................................................482-5- محیط کشت تخمیر......................................................................................................................482-6- آماده سازی کشت تلقیح..............................................................................................................492-7- شرایط تخمیر ونمونه برداری........................................................................................................492-8- تهيه منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي- جذب....................................................................502-9- تهيه منحنيهای كاليبراسيون جهت تعيين مقادیر منابع کربن.........................................................512-9-1- طرز تهيه محلول معرف DNS...............................................................................................512-9-2- رسم منحنی كاليبراسيون قندهاي قابل تبديل............................................................................51 عنوان صفحه2-10- شرایط کروماتوگرافگازی برای اندازهگیری پلیهیدروکسیآلکانواتها............................522-10-1- تهیه استاندارد داخلی.......................................................................................................532-10-2- تهیه منحنیهای کالیبراسیون متیلهیدروکسیبوتیرات، متیل هیدروکسیوالراتو متیلهیدروکسیهگزانوات...........................................................................................................532-10-3- استخراج بیوپلیمر و آماده سازی نمونه برای تزریق به دستگاه GC....................................542-10-4- روش شناسائی و تایید بیوپلیمر توسط13C NMR،1H NMR ،. FT-IR................................552-10-4-1- طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) .............................................................................552-10-4-2- طیف بینی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ......................................................552-11- فرایند بیولوژیکی جهت تولید بیوپلیمر درون سلولی در بیوراکتور.........................................562-11-1- فرایند کشت غیرپیوسته.....................................................................................................562-11-2- فرایندکشت نیمه پیوسته.....................................................................................................562- 11- 2- 1- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت منبع کربن ونیتروژن...........................572- 11- 2- 2- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی متغیر منبع کربن ونیتروژن .........................572-11-3- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور..........................................................................572-12- تولید نانو کامپوزیت پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت.........................................................................................................................59 عنوان صفحهفصل سوم- نتایج و بحث3-1- میکروارگانیسم Hydrogenophaga pseudoflava DSMZ 1034..............................623-1- 1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................623-1-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن................................................................................633-1-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن ...............................................................................653-1-3- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن ...............................................................................663- 2- میکروارگانیسم Cupriavidus necator DSM 545......................................................683-2-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی...........................................................................................683-2-1-2- بررسی تاثیر نسبت نیتروژن به کربن ..................................................................................693-2-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن................................................................................733-2-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................743-2-4- استفاده ازملاس بعنوان تنها منبع کربن...................................................................................753-2-5- تاثیر استات بر رشد میکروارگانیسم و تولید بیوپلیمر..............................................................773-2-5-1 -ترکیب ملاس و استات بعنوان منابع کربن.........................................................................773-3- میکروارگانیسم Azotobacter beijerinckii DSMZ 1041.........................................803-3-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................803-3-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................823-3-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن..............................................................................833-3-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن...............................................................................843-4- میکروارگانیسم Azohydromonas lata DSMZ 1123..............................85عنوان صفحه3-4-1- بررسی شرایط فرایند بیولوژیکی..........................................................................................853-4-2- استفاده از گلوکز بعنوان تنها منبع کربن..............................................................................873-4-3- استفاده ازفروکتوز بعنوان تنها منبع کربن .............................................................................883-4-4- استفاده ازآب پنیر بعنوان تنها منبع کربن .............................................................................893-5- نتایج کلی مقایسه چهار میکرو ارگانیسم در تولید بیوپلیمر .......................................................923-6- بررسی سینتیک رشد میکروارگانیسم در تولید بیوپلیمر............................................................923-7- فرایند کشت غیر پیوسته در بیوراکتور.....................................................................................953-7-1- تعیین ضریب انتقال اکسیژن در بیوراکتور ..........................................................................973-8- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی ثابت در بیوراکتور.................................................983-9- فرایند کشت نیمه پیوسته با خوراک دهی متغیر (پله ای) در بیوراکتور.....................................993-10- بازده بیومس ....................................................................................................................1003-11- بهره دهی .......................................................................................................................1023-12- بازده تولید ......................................................................................................................1033- 13- آزمایشهای تشخیصی جهت تایید بیوپلیمر تولید شده............................................................1053-13-1- طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) ...............................................................................1053-13-2- طیف سنجی رزونانس مغناطیسی هسته ای (NMR) ..........................................................1063-14- بررسی امکان استفاده از بیوپلیمر تولید شده در نانوکامپوزیتها.................................................108 عنوان صفحه فصل چهارم-نتیجه گیری وپیشنهادات4-1- نتیجه گیری..................................................................................................................1134-2- پیشنهادات....................................................................................................................116مراجع ...................................................................................................................................117چکیده انگلیسی ..................................................................................................................127پیوستها.................................................................................................................................128 فهرست شکلهاعنوان صفحهشکل 1-1-شمای ختار کلی پلی هیدروکسی آلکانوآتها.............................................................................8شکل 1-2- ساختار شیمیایی پلیهیدروکسیآلکانواتها ...........................................................................12شکل 1 -3- مسیر بیوسنتز پلیهیدروکسیبوتیرات و پلیهیدروکسیبوتیرات - والرات...............................14شکل1-4- تغییرات موردی یک نمونه از مواد تخریب پذیر زیستی در طول زمان............................................ 22شکل 1-5- شمائی از بیوراکتور استفاده شده جهت فرایند غیر پیوسته و پیوسته........................................ 25شکل 1-6- نمائی از فرایند پیوسته دو مرحله ای........................................................................................26شکل 1-7- مدل های رشد میکروارگانیسم ها..........................................................................................29شکل 2-1- اندازه گیری مستقیم میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت توسط روش دینامیک..............58شکل 3-1- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm ............................................................................................................62شکل 3-2-تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 12 h ................................................................................................................63شکل 3-3- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate =250 rpm ،(seed age = 12..........................................................................................................63شکل 3-4 - بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا.......64شکل 3- 5- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا.....65 عنوان صفحهشکل 3-6 - بیوپلیمر تولیدشده (PHB,PHV) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر...................66شکل 3-7 - تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm.............................................................................................................68شکل 3-8- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی (T = 30°C،(seed age = 24.....................................................................................................................69شکل 3-9- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ، (seed age = 24................................................................................................................. 69شکل 3-10- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 20) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................71شکل 3-11- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 30) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................71شکل 3-12- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز با نسبت کربن به نیتروژن 40 72شکل 3-13- تاثیر نسبت نیتروژن به کربن (1 به 50) بر روی رشد سلولی وتولید بیوپلیمر...........................73شکل 3-14- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا....75شکل 3-15-بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ملاس به عنوان سوبسترا......76شکل 3-16- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(35 به 5) به عنوان سوبسترا.................................................................................................................... 77شکل 3-17- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات بانسبت( 30 به10 ) به عنوان سوبسترا..................................................................................................................78 عنوان صفحهشکل 3-18- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(25 به 15) به عنوان سوبسترا......................................................................................... ..........................79شکل 3-19- بیوپلیمر تولیدشده ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف ترکیب ملاس و استات با نسبت(20 به 20) به عنوان سوبسترا..................................................................................................................79شکل 3-20- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age = 15 ......................................................................................................81شکل 3-21- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =15h...........................................................................81.شکل 3-22- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا ......82شکل 3-23- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا ...83شکل 3-24- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا ....85شکل 3-25- تاثیر سن تلقیح بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C، (shaking rate = 250 rpm.....................................................................................86شکل 3- 26- تاثیر شدت هم زدن بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(T = 30°C،(seed age =18 ..........................................................................................................86شکل 3- 27- تاثیر دما بر روی رشد سلولی تولید بیوپلیمردر شرایط فرایند بیولوژیکی(shaking rate = 250 rpm ،(seed age =18 ............................................................................87شکل 3-28- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف گلوکز به عنوان سوبسترا......88عنوان صفحهشکل 3- 29- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف فروکتوز به عنوان سوبسترا....89شکل 3- 30- بیوپلیمر تولیدشده(PHB) ومیزان رشد سلولی به ازای مصرف آب پنیر به عنوان سوبسترا ...90شکل 3-31- برازش مدل سینتیکی مونود در فرایند تولید پلی هیدروکسی بوتیرات ...................................94شکل 3- 32- برازش مدل مالتوس بر روی داده های آزمایشگاهی حاصل از فرایند تولید بیوپلیمرتوسط .............................................................................................................................94C. necatorشکل 3-33 - تولید جرم سلولی وپلی هیدروکسی بوتیرات توسط C.necatorدر فرایند غیر پیوسته.......96شکل 3-34 – اندازه گیری میزان اکسیژن انتقال یافته به محیط کشت بیوراکتور توسط روش دینامیک......97شکل 3-35 - فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک دهی ثابت گلوکز ونیتروژن...98شکل 3-36 - فرایند نیمه پیوسته تولید پلی هیدروکسی بوتیرات با خوراک متغیر گلوکز ونیتروژن.........100شکل 3-37- طیف FT- IR از نمونه پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات تولید......................105شکل 3-38- طیف FT- IR از نمونه استاندارد تهیه شده پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات..106شکل 3-39- طیف 1HNMR حاصل از کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات..........107شکل 3-40- طیف 13CNMR حاصل از کوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات........108شکل 3- 41- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات/ هیدروکسی والرات...................109شکل 3-42- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت .............................................................................................................................110شکل 3-43- تصویر SEM از سطح فیلم پلی هیدروکسی بوتیرات هیدروکسی والرات/هیدروکسی اپتایت تحت اواتراسونیک................................................................................................111 عنوان صفحهشکل پ-1-منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری C. necator.............................................129شكل پ-2- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Hydrogenophaga pseudoflava....129شكل پ-3- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Azotobacter beijerinckii................130شكل پ-4- منحني كاليبراسيون وزن خشك سلولي باکتری Azohydromonas lata .....................130شكل پ-5- منحنی کالیبراسیون گلوکز..................................................................................................131شكل پ-6- منحنی کالیبراسیون فروکتوز................................................................................................131شكل پ- 7- منحنی کالیبراسیون لاکتوز......................................................................................132شكل پ-8- منحنی کالیبراسیون 3- متیلهیدروکسیبوتیرات، 3-متیلهیدروکسیوالرات و3-متیل هیدروکسیهگزانوات................................................................................................................132شکل پ 9- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 200..........................................................133شکل پ 10- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 400........................................................134شکل پ 11- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 600........................................................135شکل پ 12- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 800........................................................136شکل پ 13- نمودار کروماتوگرام GC برای استاندارد ppm 1000......................................................137شکل پ 14- طیف حاصل از FT-IR بیوپلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات/هیدروکسی والرات................138شکل پ 15- طیف C NMR کوپلیمر( پلی 3- هیدروکسی بوتیرات/ 4- هیدروکسی بوتیرات)به دست آمده از فرایند رشدC. necator بر روی روغن نخل.............................................................139شکل پ 16- طیف C NMR بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشدC. necator بر روی سوبستراهای کیک سویا و مخلوط کیک سویا و ملاس....................................140شکل پ 17. طیفهایC NMR وH NMR کوپلیمرPHBV به دست آمده از مخمر نوترکیب........140شکل پ 18 . طیف H NMR بیوپلیمر( پلی هیدروکسی بوتیرات به دست آمده از فرایند رشدE.coli T.V.N. ..............................................................................................................................141شکل پ 19. طیف H NMR کوپلیمر PHBV به دست آمده از Comamonas sp. EB172 .....141 فهرست جداولعنوان صفحهجدول 1-1- برخی از باکتریهای مورد استفاده در تولید پلیهیدروکسیآلکانواتها...................................9جدول 1-2- میکروارگانیسمها و منابع مورد استفاده در تولید کوپلیمر هیدروکسیبوتیرات – والرات........13جدول1-3- مقایسه برخی از خواص فیزیکی پلیمرهای تولیدی................................................................19جدول 1-4- برخی از میکروارگانیسمهای جداسازی شده جهت تجزیه PHAs....................................21جدول1-5- تعدادی از متداول ترین مدلهاي رشد غير ساختاري............................................................30جدول 1-6- شرکتهای تولیدکننده پلیمرهای زیستتخریبپذیر..............................................................38جدول 2-1- اجزای محیط کشت تولید (DSMZ, Medium 81) ...................................................46جدول 3- 1- نتایج حاصل از فرایند بیولوژیکی تولید بیوپلیمر توسط میکروارگانیسم ها بر رویمنابع مختلف کربنی................................................................................................................................91جدول 3- 2- مدلهای سینتیکی به کار برده شده برای تولیدپلی هیدروکسی بوتیرات با استفاده از گلوکز..93جدول 3-3- پارامترهای سینتیکی جهت تولید پلی هیدروکسی بوتیرات از منابع کربنی مختلف................95جدول 3-4- حداکثر بازدهی تولید با استفاده از ترکیبات مختلف...........................................................104 مقدمهاستفاده از پليمرها و پلاستيك ها در اغلب وسايل انسان از ريزترين آنها گرفته تا بزرگترين آنها انكار ناپذير است. دليل اين استفاده وافر پليمرها و پلاستيك ها در زندگي انسان خواص بسيار زياد آنها مي باشد. مصرف سرانه پلاستيك در اروپا 60 كيلوگرم و در آمريكا 80 كيلوگرم در سال است [1]. عليرغم فوايد فراوان پليمرها و پلاستيك ها، استفاده از آنها باعث معضلات زيست محيطي فراوان شده است و همين امر باعث شده است كه بشر به فكر توليد پليمرهاي زيست تخريب پذير و تخريب زيستي پليمرها و پلاستيك ها بيافتد.مکانيسمهاي دروني و توانايي خود تنظيمي طبيعت نمي توانند اين آلاينده ها را تجزیه کنند چون با اين مواد نا آشنا هستند. اين امر موجب شده است بسياري از کشورها شروع به توسعه پلاستيک هاي قابل تجزيه زيستي کنند. بر اساس يک تخمين، بيش از 100 ميليون تن پلاستيک هر ساله توليد مي شوند. 40% از اين مقدار به محل هاي دفن زباله منتقل مي شود و چند صد هزار تن هر ساله به محيط هاي دريايي ريخته مي شوند و در مناطق اقيانوسي تجمع مي يابند. سوزاندن پلاستيک ها يکي از گزينه ها در دفع پلاستيک ها مي باشد؛ اما علاوه بر پرهزينه بودن خطرناک نيز مي باشد[1-2].پلاستيک هايي که کاملا تجزيه پذیرند، نسبتاٌ جديد و نويد دهنده اند که به خاطر بهره گیری از باکتريها براي تشکيل بيوپليمر مي باشد که عمدتاٌ شامل پلی هیدروکسی آلکانویت ها[1]، پلی لاکتیک اسیدها[2]، پلی استرهای آلیفاتیک[3]، پلی ساکاریدها[4]، و يا ترکيبي از اين مواد مي باشند[1]. 1- انواع پلیمرهای زیست تخریب پذیرپليمرهاي زيست تخريب پذير زيادي شناسايي شده اند و يكي از مهمترين آنها پلي هيدروكسي آلكانوات ها مي باشد. استفاده از اين گروه پليمرهاي زيست تخريب پذير در كشاورزي و صنايع دارويي و غيره بسيار مورد توجه قرار گرفته است كه دليل آن سازگاري با محيط زيست و سامانه هاي حياتي مي باشد[2].پلي هيدروكسي آلكانوات ها ،پليمرهاي زيست تخريب پذير هستند و به صورت ذرات درون سلولي در ميکروارگانيسم هاي مختلف تشکيل مي شوند[3]. وزن مولکولي اين پليمرها در محدوده 105*2 تا 106*3 دالتون مي باشد. وزن مولکولي بر حسب نوع ميکروارگانيسم و شرايط رشد تغيير مي کند[3].يکي ازمهمترين پلي هيدروکسي آلکانوات ها، پلي هيدروكسي بوتيرات است. پلي هيدروكسي بوتيرات يك پليمر خطي از 3-هيدروكسي بوتيرات است و در اندازه هاي مختلفي از ذرات در داخل سلول موجود است. پلي هيدروكسي بوتيرات به عنوان يك منبع ذخيره انرژي و كربن براي ميكروارگانيزم مي باشد و تحت شرايطي مثل محدوديت نيتروژن، فسفر، اكسيژن، يون ها و غيره در داخل سلول تجمع مي يابد و با رفع اين محدوديت ها پلي هيدروكسي بوتيرات تجزيه مي شود. پلي هيدروكسي بوتيرات جامد به عنوان يك پلي استر ترموپلاستيك زيست تخريب پذير مورد توجه قرار گرفته است زيرا خواص شبيه به خواص تعداد زيادي از پلاستيك هاي سنتزي معمولي دارد[4-6].