فهرست عنوان......... صفحه1- مقدمه21- 1- مقدمه‌اي بر بيوتكنولوژي21-2- بيوتكنولوژي- يك هسته مركزي با دو جزء41-3- مقدمه‌اي بر فرآيندهاي تخميري51-3-1- بخش‌هاي اصلي فرايند تخميري71-3-2- محيط كشت تخمير صنعتي82- مروري بر كارهاي گذشته112-1- مروري بر كاربردهاي كشت نيمه‌پيوسته (غير مداوم خوراك‌دهي شده)112-2- مروري بر توليد بوتانل از طريق كشت ميكروبي132-3- مروري بر بهينه‌سازي فرايندهاي تخمير نيمه‌پيوسته133- فرايند163-1- طراحي فرمانتور173-2-كشت نيمه پيوسته (غير مداوم خوارك‌دهي‌شده)193-2-1- مزاياي كشت نيمه پيوسته (غير مداوم خوارك‌دهي‌شده)203-3- بوتانول(بوتیل الکل)223-3- 1-روش های تولید بوتانول253-3-2-1- استفاده از بوتانول به عنوان جایگزین سوخت های فسیلی253-3-1-2-تحقيقات انجام شده در زمينه توليد بيولوژيکي بوتانول27فصل چهارم294- مدلسازي304-1- مدلبيوراكتور نيمه پيوسته304-2- مدل‌هاي رشد ميكروارگانيسم‌ها314-2-1- مدل‌هايساختار نيافته314-2-1-1- مدل‌هاي مونود، هالدن، كناك، تيسير و موزر314-2-1-2- مدل شبكه عصبي334-2-2- مدل‌هايساختاريافته334-2-2-1- مدل‌هاي مبتني بر آناليز موازنه فلاكس (FBA)354-2-2-2- مدل‌هاي مبتني بر آناليز موازنه فلاكس پويا (DFBA)394-3- مدلسازي مورد استفاده در اين تحقيق404-3-1- معادلات حاكم414-4-1- مدل آناليز موازنه فلاکس پويا براي کشت ناپيوسته گونه طبيعي (وحشي) باکتري کلستریدیوم استوبوتیلیکوم424-4-1-1- تعيين پارامترهاي بهينه معادلات جذب مواد غذايي434-4-2- مدل آناليز موازنه فلاکس پويا براي کشت نيمه پيوسته گونه جهش يافته باکتري کلستریدیوم استوبوتیلیکوم505- بهينه‌سازي595-1- استراتژي عملياتي616- نتايج، بحث و نتيجه گيري646-1- نتايج حاصل از بهينه سازي646-2- مطالعات موضوعي676-3- بحث و نتيجه گيري68منابع70پيوست يك74پيوست دو80فهرست شکل ها و نمودارها عنوان و شماره................................................................................................................. صفحه شكل (3-1)- نمايي كلي از يك بيو‌راكتور پيوسته.....................................................................17شكل(3-2)- مواد شیمیایی تولیدی از بوتانول....................................................................23شكل (4-1)- شبكه متابوليكي ساده اي از باكتري اي-كلاي............................................. 36شكل (4-2)- روش FBA.............................................................................................................37شكل (4-3)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير سرعت رشد ويژه سويه طبيعي حاصل از حل مکرر مسأله برنامه‌ريزي خطي بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن............... 44شكل (4-4)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير فلاکس خروجي هیدروژن حاصل از حل مکرر مسأله برنامه‌ريزي خطي بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن.............................45شكل (4-5)- نمودار تغييرات غلظت گلوكز در بيوراکتور ناپيوسته......................................... 48شكل (4-6)- نمودار تغييرات غلظت توده زيستي در بيوراکتور ناپيوسته................49شكل (4-7)- نمودار تغييرات غلظت محصولات در بيوراکتور ناپيوسته..................................49شكل (4-8)- حذف ژن بصورت شماتيک......................................................................51شكل (4-9)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير سرعت رشد ويژه سويه جهش يافته، حاصل از حل مکرر مسأله برنامه‌ريزي خطي بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن...52شكل (4-10)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير فلاکس اتانول در سويه جهش يافته، حاصل از حل مکرر مسأله برنامه‌ريزي خطي بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن...47شكل (4-11)- رويه سه بعدي مربوط به مقادير فلاکس بوتانل در سويه جهش يافته، حاصل از حل مکرر مسأله برنامه‌ريزي خطي بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن............... 53شكل (4-12)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير سرعت رشد ويژه سويه جهش يافته، حاصل از شبيه سازي با شبکه عصبي مصنوعي، بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن...................................................................................................................................................... 55شكل (4-13)- رويه هاي سه بعدي مربوط به مقادير فلاکس اتانول در سويه جهش يافته، حاصل از شبيه سازي با شبکه عصبي مصنوعي، بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز، هیدروژن ورودي...........................................................................................................................................................55شكل (4-14)- رويه سه بعدي مربوط به مقادير فلاکس بوتانل در سويه جهش يافته، حاصل از شبيه سازي با شبکه عصبي مصنوعي، بر حسب فلاکسهاي ورودي گلوکز و هیدروژن ورودي...........................................................................................................................................................56شكل (6-1)- تغييرات غلظت توده زيستي در بيوراکتور نيمه پيوسته.....................................65شكل (6-2)- تغييرات مقدار گلوکز در كشت نيمه پيوسته........................................................66شكل (6-3)- تغييرات مقدار محصولات در كشت نيمه پيوسته................................................66شكل (6-4)- تغییرات ژنتیکی اعمال شده در میکروارگانیسم...................................................67فهرست جدول ها عنوان.................................................................................................................................................صفحه جدول (3-1)- استانداردهاي مواد مورد استفاده در يك فرمانتور پيچيده..............................17جدول (4-1)- ميزان خطاي مطلق و نسبي شبکه عصبي مصنوعي انتخابي مربوط به سرعت رشد ويژه براي داده هاي آموزش و تست در مورد سويه طبيعي.....................................................46جدول (4-2)- ميزان خطاي مطلق و نسبي شبکه عصبي مصنوعي انتخابي مربوط به فلاكس اتانول براي داده هاي آموزش و تست در مورد سويه طبيعي.............................................46جدول (4-3)- مقادير فلاکس ماکزیمم هیدروژن و گلوکز براي سويه طبيعي باكتري کلستریدیم استوبوتیلیکم در شرايط اسیدی و خنثی.........................................................................47جدول (4-4)- مقادير پارامترهاي بهينه معادلات جذب براي سويه طبيعي باكتري کلستریدیم استوبوتیلیکم در فاز اسیدی.............................................................................................. 47جدول (4-5)- مقادير پارامترهاي بهينه معادلات جذب براي سويه طبيعي باكتري کلستریدیم استوبوتیلیکم در شرايط خنثی...........................................................................................48جدول (4-6)- مقادير ميانگين درصد خطاي مطلق و نسبي مربوط به تغييرات غلظت گلوکز، توده زيستي، بوتانل، اتانول و استون در شرایط ناپیوسته.....................................................50جدول (4-7)- ميزان خطاي مطلق و نسبي شبکه عصبي مصنوعي انتخابي مربوط به سرعت رشد ويژه براي داده هاي آموزش و تست در مورد سويه جهش يافته............................................54جدول (4-8)- ميزان خطاي مطلق و نسبي شبکه عصبي مصنوعي انتخابي مربوط به فلاكس بوتانل براي داده هاي آموزش و تست در مورد سويه جهش يافته...........54جدول (4-9)- ميزان خطاي مطلق و نسبي شبکه عصبي مصنوعي انتخابي مربوط به فلاكس اتانول براي داده هاي آموزش و تست در مورد سويه جهش يافته....................................54جدول (6-1)- مقادير بهينه حاصل براي متغيرهاي تصميم گيري...........................................64جدول (6-2)- مقادير پارامترهاي كليدي در حل مسئله بهینه سازی.....................................65 فهرست نشانه های اختصاری حجم مايع داخل راكتور(L)Vدبي جريان خوارك(L/hr)Fغلظت جرمي سلول‌هاي ميكروارگانيسم(g/L)Xغلظت سوبستراي اصلي (محدودكننده رشد) (mmol/L)Sغلظت محصول مطلوب(mmol/L)Pغلظت سوبستراي اصلي در خوراك ورودي(mmol/L)Sfثابت ممانعت سوبسترا(mmol/L)Kisثابت ممانعت محصول(mmol/L)Kipثابت اشباع سوبسترا(mmol/L)Ksفلاكس تبديلي در غشاء سلولي براي سوبسترا(mmol/gDW. hr)νsفلاكس تبديلي در غشاء سلولي براي محصول(mmol/gDW. hr)νpسرعت رشد مشخصه (1/hr)μبيشينه سرعت رشد(1/hr)μmaxبازدهي (ميزان توليد جرم سلولي به ازاء يك واحد جرم از سوبستراي مصرفي)YX/Sمعكوس ميزان بازدهي محصول در اثر رشد سلول‌هاαمعكوس ميزان بازدهي محصول مستقل از رشد سلوليβجرم سلول خشك بر حسب گرمgDWفصل اول1- مقدمه 1- 1- مقدمه‌اي بر بيوتكنولوژيبيترديد زيست‌شناسي جديد با آرايش مبهوت‌كننده‌اي از رشته‌هاي فرعي گوناگون مثل ميكروبشناسي، كالبدشناسي جانوري و گياهي، زيست شيمي، ايمني‌شناسي،زيست‌شناسي سلولي، فيزيولوژي گياهي و جانوري، ريخت‌زايي، سيستماتيك[1]، بوم‌شناسي، ديرينه‌شناسيگياهي، ژنتيك و بسياري از رشته‌هاي ديگر، متنوع‌ترين بخش علوم طبيعي است. تنوع فزاينده زيست‌شناسي جديد بيشتر از آنجا ناشي مي‌شود كه پس از جنگ جهاني دوم، رشته‌هاي علمي ديگر چون فيزيك، شيمي، و رياضيات در زيست‌شناسي به كار گرفته شد و توصيف فرآيندهاي زيستي را در حد سلول و هسته سلولي امكان‌پذير ساخت.زيست‌شناسي جديد تاكنون سهم مهمي در رفاه و سلامت بشر داشته است. با اين حال آنچه تاكنون از اين راه به دست آمده است، در قياس با نويدهايي كه در سايه بيوتكنولوژي تحقق خواهد يافت بسيار ناچيز است.بيوتكنولوژي[2] را تحت عنوان «به‌كارگيري ارگانيسم‌ها يا فرايندهاي زيستي در صنايع توليدي و خدماتي» تعريف كرده‌اند. بيوتكنولوژي دانشي است كه كاربرد يكپارچه زيست‌شيمي، ميكروبشناسي و تكنولوژي‌هاي توليد را در سيستم‌هاي زيستي، به جهت استفاده‌اي كه در سرشت بين رشته‌اي علوم دارند، مطالعه مي‌كند.بيوتكنولوژي صنايع كاملاً نويني خواهد آفريد كه انرژي فسيلي اندكي لازم دارند و اقتصاد جهاني را تغيير خواهد داد. فرايندهاي بيوتكنولوژيك در بيشتر موارد با صرف انرژي كم در دماي پايين انجام مي‌شود و در بيوسنتز[3] عمدتاً متكي بر مواد ارزان هستند. فعاليت‌هاي صنعتي تحت تأثير آن شامل توليد غذا براي انسان و جانوران، تدارك مواد خام شيميايي به جاي منابع پتروشيميايي، منابع جايگزين انرژي، به گردش درآوردن پسماندها در طبيعت، كنترل آلودگي، كشاورزي و توليد مواد جديد براي ياري رساندن و متحول كردن بسياري از جنبه‌هاي پزشكي، علوم دامپزشكي و دارويي است. بيوتكنولوژي از نظر بين‌المللي همانقدر (چه‌بسا بيشتر) نويد بخش استفاده‌هاي تجاري است كه انقلاب ميكروالكترونيك[4] فراهم كرد. بويژه آنكه صنايع بيوتكنولوژيك عمدتاً بر پايه مواد تجديدشدني و گردش‌پذير خواهد بود و از اين‌رو مي‌تواند با نيازهاي جامعه‌اي كه در آن انرژي روز به روز گران‌تر و كميابتر مي‌شود سازگار شود. بيوتكنولوژي از جهات بسيار هنوز يك تكنولوژي نوپا بوده و پيشرفت‌هايش مستلزم كنترل ماهرانه است، اما توانايي‌هاي آن گسترده و متنوع است و بي‌ترديد در بسياري از فرآيندهاي صنعتي آينده نقش مهم و فزاينده‌اي خواهد داشت.بيوتكنولوژي ذاتاً حرفه‌اي بين رشته‌اي است. بيوتكنولوژيست[5] فنون مأخوذ از شيمي، ميكروبشناسي، مهندسي شيمي و دانش كامپيوتر را به كار مي‌گيرد. اهداف اصلي آن، نوآوري، توسعه و اجراي مطلوب فرايندهايي است كه كاتاليزور[6] زيست شيميايي در آن نقش اصلي و غير قابل جايگزيني دارد. بيوتكنولوژيست‌ها بايد با متخصصين ساير قلمروهاي وابسته مانند پزشكي، تغذيه، صنايع شيميايي و دارويي، حفظ محيط زيست و تكنولوژي به عمل‌آوري مواد پسماند نيز همكاري نزديك داشته باشند. خاستگاه بسياري از فرايندهاي بيوتكنولوژيك فعلي به تخميرهاي سنتي و باستاني مانند توليد نان، پنير، ماست و سركه بر مي‌گردد. اما كشف آنتي‌بيوتيك‌ها[7] در سال 1929 و سپس توليد انبوه آنها در دهه 1940 بيشترين پيشرفت‌ها را در تكنولوژي تخمير فراهم آورد. از آن پس ما نه تنها در توليد آنتي‌بيوتيك‌ها، بلكه در توليد بسياري از فرآورده‌هاي شيميايي ساده يا پيچيده مفيد، به عنوان مثال اسيدهاي آلي، پلي‌ساكاريدها، آنزيم‌ها، واكسن‌ها، هورمون‌ها و غيره شاهد توسعه شگفت‌انگيز تكنولوژي تخمير بوده‌ايم. علت اصلي توسعه فرايندهاي تخميري رابطه نزديك و فزاينده بين زيست‌شيميدان‌ها، ميكروب‌شناسان و مهندسان شيمي است.مهم‌ترين دليل براي آگاهي روزافزون از بيوتكنولوژي، رسيدن به اين واقعيت بود كه منابع سوختهای فسيلی محدود است. بنابراين انسان بايد در پي شيوه‌هايي باشد كه با استفاده از توده زيستي[8]، مستقيم و غير مستقيم انرژي خورشيدي را به شكل قابل استفاده درآورد. از اين توده زيستي بسياري از مواد شيميايي ضروري براي بقاي انسان به دست خواهد آمد. گرچه صنايع تخميري سنتي هميشه در بيوتكنولوژي نقش مركزي خواهد داشت، اميد بيوتكنولوژيست‌ها امروزه عمدتاً به كاربردهاي دو كشف زيست‌شناسي بر مي‌گردد كه عبارتند از:الف) توسعه تكنولوژي يا مهندسي آنزيمي، يعني استفاده از واحدهاي زيستي جداشده با آنزيم‌ها در صنعت و پزشكي.ب) مهندسي ژنتيكي، يعني استفاده از توانايي تازه كسب‌شده انسان در انتقال اطلاعات ژنتيكي بين ارگانيسم‌هاي كاملاً غير منسوب و دور از هم، مانند گياهان، جانوران و ميكروارگانيسم‌ها.اين قلمروها اساساً در پي بهره‌برداري از كشفيات زيست‌شناسي مولكولي و آنزيمولوژي[9] است و واژه مهندسي مولكول‌هاي زيستي براي استناد به مجموعه اين دو به كار مي‌رود.