فهرست مطالبعنوان صفحهچکیده: ........ 1 فصل اول: مقدمات و کلیات 1-1-بیان مسئله ..... 31-2-اهداف تحقیق ....... 41-3-فرضیه های تحقیق........ 41-4- مفهوم نانوتکنولوژی ..... 51-4-1-کاربردهای نانوتکنولوژی..... 51-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی...... 51-4-1-2- پزشكي و بدن انسان...... 61-4-1-3- پایداری منابع...... 61-4-1-4- صنایع غذایی........ 61-5-آنزیم ها........ 81-5-1-خصوصیات آنزيم ها........ 81-5-2- خصوصیات واکنشهای آنزیمی... 111-5-3- پارامترهای موثر بر واکنشهای آنزیمی..... 141-5-3-1- دما........ 141-5-3-2-pH ........ 141-5-3-3-بازدارندهها............................................................................... 151-5-4- سینتیک واکنش آنزیمی................................................................... 161-5-5-عوامل موثر برسرعت و فعالیت آنزیمها ............................................... 171-5-5-1-اثر غلظت ماده اولیه برسرعت واکنش آنزیمی...................................... 171-5-6- معادله میکائیلیس- منتن................................................................... 181-5-7- معادله لینویور- برک ..................................................................... 211-5-8- آنزیم لیپاز................................................................................... 231-5-8-1-كاربرد ليپاز.............................................................................. 251-5-8-2- سینتیک واکنش لیپاز................................................................... 271-5-8-3-روش های اندازهگیری فعالیت لیپاز................................................... 281-6- تثبيت آنزيم ................................................................................... 301-6-1- انتخاب پایه و روش مناسب جهت تثبیت آنزیم........................................ 311-7- کیتین و کیتوسان ............................................................................. 321-7-1- کیتین........................................................................................ 331-7-2- کیتوسان..................................................................................... 341-7-2-1- کاربردهای کیتوسان.................................................................... 351-8-تعیین مشخصات نانوذرات کیتوسان ........................................................ 38 فصل دوم: ادبیات و پیشینه تحقیق 2-1-مروری برمطالعات آنزیمی .................................................................. 412-2-مروری بر پیشینه آنزیم لیپاز ................................................................ 422-3-تاریخچه تولید کیتین و کیتوسان ............................................................. 442-4-تاریخچه تثبیت آنزیم روی نانو ذرات ...................................................... 452-5-تحقیقات پیشین در این زمینه ................................................................ 46 فصل سوم: مواد و روش ها 3-1- مقدمه ........................................................................................... 513-2-مواد شیمیایی ................................................................................... 523-3-وسائل و دستگاه های مورد نیاز ............................................................ 543-3-1-ظروف آزمایشگاهی........................................................................ 543-3-2-دستگاهها..................................................................................... 543-4-روشهای آزمایشگاهی بکار گرفته شده در پایان نامه ................................... 583-4-1-سنتز نانو ذرات کیتوسان ................................................................. 583-4-2-تثبیت آنزیم لیپاز به روش اتصال کووالان بر اساس واکنش باز شیف............ 593-4-3-تعیین خصوصیات نانو ذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی603-4-4-تعیین توزیع اندازه ذرات نانوکیتوسان سنتز شده به روش تفرق نور با استفاده از زتاسایزر613-4-5-طیف سنجی مادون قرمز(FT-IR) ..................................................... 623-4-6- اندازهگیری پروتئین تام به روش برادفورد............................................. 623-4-7-اندازهگیری مقدار پروتئین (لیپاز) تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان............ 633-4-8-اندازهگیری فعالیت آنزیم لیپاز............................................................. 633-4-8-1-منحنی استاندارد فعالیت لیپاز.......................................................... 643-4-8-2-روش اول- اندازهگیری فعالیت لیپاز به روش کیت پارس آزمون (کیت تشخیصی کمی Lipase DC) در سرم یا پلاسما به روش فتومتریک............................................................. 663-4-8-3-روش دوم- اندازهگیری فعالیت لیپاز با استفاده از سوبسترای پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) 683-4-9- بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان 683-4-10-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز در حالت آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان 693-4-11-بررسی پارامتر های سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 69 فصل چهارم: نتایج 4-1-مقدمه ............................................................................................ 714-2-تصویر برداری میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ............................. 714-3-طیف سنجی مادون قرمز تبدیل فوریه (FT-IR) ......................................... 724-4-توزیع اندازه نانوذرات سنتز شده با استفاده از زتا سایزر ............................... 744-5-فعالیت لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان .................... 754-6-بررسی اثر pH بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 764-7-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف ...... 774-8-بررسی اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 784-9-مقایسه درصد فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در دماهای مختلف ......... 794-10-پارامترهای سینتیکی آنزیم لیپازسودوموناس آزاد و تثبیت شده روی نانو ذره کیتوسان 80 فصل پنجم: بحث و نتیجهگیری بحث.................................................................................................... 83نتیجه گیری .......................................................................................... 87مشکلات وپیشنهادات ............................................................................... 89منابع و مآخذ.......................................................................................... 90فهرست منابع فارسی................................................................................. 91فهرست منابع غیر فارسی........................................................................... 92چکیده انگلیسی....................................................................................... 100 فهرست جداولعنوان صفحهجدول 1-1- نمونههایی ازکاربردهای صنعتی لیپاز ................................................... 26جدول 1-2- مزایا و معایب تثبیت آنزیم ................................................................. 31جدول 1-3- کاربردهای مختلف کیتوسان ............................................................... 37جدول 3-1- محتویات معرف شماره یک در pH=8 ................................................ 66جدول 3-2- محتویات معرف شماره دو در pH=4.................................................... 66جدول 3-3- روش کار اندازهگیری فعالیت لیپاز با استفاده از کیت پارس آزمون ................. 67جدول 4-1- اثر تغییرات pHبر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده روی نانو کیتوسان در دمای °C40......................................................................................................... 76جدول 4-2- اثر تغییرات دما برفعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان در pH، 5/7 ................................................................................................................ 78جدول 4-3- مقادیر پارامترهای سینتیکی ............................................................... 80 فهرست نمودارهاعنوان صفحهنمودار 3-1- منحنی استاندارد جهت تعیین فعالیت لیپاز در طول موج 410 نانومتر به روش اسپکتروفتومتری ................................................................................................................ 64نمودار4-1- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد .......................... 73نمودار4-2- طیف مادون قرمز تبدیل فوریه آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده روی نانوذره کیتوسان 73نمودار4-3- زتا سایزر نانو ذرات کیتوسان قبل از تثبیت آنزیم لیپاز ............................... 74نمودار4-4-زتا سایزر ذرات کیتوسان لیپاز تثبیت شده با گلوتارآلدئید............................... 75نمودار4-5- اثر pHبر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان ........ 76نمودار4-6- مقایسه فعالیت نسبی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده در pH های مختلف ............. 77نمودار4-7- اثر دما بر فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان .......... 78نمودار4-8- مقایسه درصد فعالیت نسبی لیپاز آزاد و تثبیت شده سودوموناس در دماهای مختلف 79نمودار4-10- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس آزاد ......................... 81نمودار4-11- منحنی میکائیلیس- منتن برای آنزیم لیپاز سودوموناس تثبیت شده بر روی نانو ذره کیتوسان ................................................................................................................ 81فهرست شکل هاعنوان صفحهشکل 1-1- نمونه ای از مسیر واکنش برای واکنش کاتالیز شده ..................................... 9شکل 1-2- ساختار آنزیم .................................................................................. 10شکل 1-3- الگوی القایی مدل کوشلند- حالت دست دردستکش ..................................... 15شکل 1-4- اثر غلظت ماده اولیه بر سرعت واکنش آنزیمی.......................................... 17شکل 1-5- صورت اجمالی اثر غلظت ماده اولیه بر مقدار کمپلکس آنزیم- ماده اولیه تشکیل شده 18شکل 1-6- منحنی فرضی واکنش آنزیمی .............................................................. 19شکل 1-7- منحنی اشباع آنزیمی ......................................................................... 20شکل 1-8- نمودار لینویور- برک ....................................................................... 22شکل 1-9- ساختار سه بعدی آنزیم لیپاز ................................................................ 23شکل 1-10- طرح شماتیکی واکنش لیپولیز ........................................................... 28شكل 1-11- رايج ترين روشهاي تثبيت ................................................................ 32شکل 1-12- مقایسه ساختار شیمیایی کیتین و سلولز .................................................. 33شکل 1-13- ساختار کیتین و کیتوسان .................................................................. 35شکل 1-14- مقایسه ساختارشیمیایی کیتین و کیتوسان و سلولز ..................................... 38شکل 3-1- فرمول شیمیایی گلوتارآلدئید................................................................. 52شکل 3-2- فرم فضایی گلوتارآلدئید...................................................................... 52شکل 3-3- سانتریفیوژ مورد استفاده در این تحقیق.................................................... 54شکل 3-4- سنیکیتور مورد استفاده در این تحقیق...................................................... 55شکل 3-5- اسپکتروفتومتر مورد استفاده در این تحقیق............................................... 55شکل 3-6- استیرر مورد استفاده در این تحقیق......................................................... 56شکل 3-7- شیکرلوله مورد استفاده در این تحقیق...................................................... 56شکل 3-8-pH متر مورد استفاده در این تحقیق....................................................... 57شکل 3-9- ترازوی دیجیتال مورد استفاده در این تحقیق.............................................. 57شکل 3-10- حمام آبی مورد استفاده در این تحقیق..................................................... 58شکل 3-11- میکروسکوپ الکترونی روبشی مورد استفاده در این تحقیق......................... 60شکل 3-12- دستگاه زتاسایزر مورد استفاده در این تحقیق........................................... 61شکل 4-1- تصویر نانوذره کیتوسان با استفاده از میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) ... 72 چکیده:لیپازها یکی از مهمترین آنزیمها در سیستمهای بیولوژیکی در صنایع مختلف است. کاربرد لیپاز آزاد به دلیل نیمه عمر کمتر در صنایع مقرون به صرفه نیست. تثبیت آنزیم روی پایههای مختلف باعث افزایش پایداری، استفاده مکرر، سهولت جداسازی محصول، کنترل بیشتر واکنش و هزینه کمتر میشود. تثبیت آنزیم غالبا بر روی پایه های متخلخل آلی یا معدنی انجام میشود اما در سالهای اخیر از انواع نانوذرات به دلیل سطح تماس بالا در واحد حجم استفاده شد. هدف از این مطالعه سنتز نانوذرات کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز بطریق کووالان با واسطه گلوتارآلدئید روی نانوذره و مقایسه فعالیت و پارامترهای سینتیکی آنزیم آزاد و تثبیت شده میباشد. ابتدا نانو ذره کیتوسان در آزمایشگاه سنتز و سپس عملیات تثبیت آنزیم بطریق کووالانسی از طریق واکنش بازشیف انجام شد. و با روشهای میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM)، طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) و زتا سایزر مورد بررسی و تأیید قرار گرفت. در مرحله بعد فعالیت آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده به دو روش کیت تشخیصی پارس آزمون و روش استاندارد پارانیتروفنیل پالمیتات (pNPP) اندازهگیری و پارامترهای سینتیکی Km و Vm تعیین شدند. نتایج میکروسکوپ الکترونی نشان داد که اندازه نانوذرات کیتوسان کمتر از nm100 است و بر اساس نتایج زتاسایزر اندازه ذرات قبل از تثبیت در محدوده nm300-10 و بعد از تثبیت آنزیم در محدوده nm500-20 بود. همچنین طیف FT-IR لیپاز آزاد و تثبیت شده بترتیب دارای پیک جذبی در طول موج cm-1 1645 و cm-19/1646 میباشند که تثبیت لیپاز روی نانوذرات را تأیید نمود. pH بهینه لیپاز آزاد 7 و تثبیت شده، 5/7 بدست آمد. همچنین لیپاز آزاد در دمای °C30 وتثبیت شده در °C40 بیشترین فعالیت را نشان داد. اگرچه میزان پایداری و نیمه عمر کمتری در مقایسه با آنزیم تثبیت شده داشت.براساس نتایج مطالعه حاضر میتوان آنزیم لیپاز را بطور کووالان با واسطه گلوتارآلدئید با موفقیت روی نانوذرات کیتوسان تثبیت نمود و آنزیم تثبیت شده دارای فعالیت و خصوصیات سینتیکی مناسبی برای کاربرد در صنایع مختلف است.کلمات کلیدی:نانوکیتوسان، لیپازسودوموناس، تثبیت، فعالیت آنزیم، خصوصیات سینتیکی فصل اولمقدمات و کلیات1-1-بیان مسئله:لیپاز آنزیمی است که چربی را به اسید چرب و الکل هیدرولیز میکند.لیپاز یک آنزیم همه کاره است که کاربرد های صنعتی بسیاری دارد. اما پایداری لیپاز در محیط های مختلف نظیر آنزیمهای دیگر بیش از اندازه پایین میباشد تا امکان استفاده آن را تحت شرایط سخت که برای کاربردهای صنعتی لازم میباشد، میسرکند. به علاوه لیپاز گران قیمت است و به لحاظ اقتصادی استفاده از لیپاز به فرم آزاد مقرون به صرفه نیست و چون نیمه عمر آنزیم آزاد کمتر است و قابلیت بکارگیری مکرر آن محدودیت دارد لذا از آنزیم تثبیت شده بر روی بسترهای مختلف استفاده میکنند. به دلیل قابلیت حل بالای آن در آب نمیتوان از آن مجددا استفاده کرد. بسیاری از تحقیقات استفاده از تکنیک های تثبیت را برای غلبه بر این محدودیت ها مورد بررسی قرار دادند.برای تثبیت آنزیم لیپاز غالبا از پایه های متخلخل آلی استفاده میشد اما در سال های اخیر از انواع نانو ذرات به دلیل سطح تماس بالا و حجم بالای منافذ که ورود مولکولهای آنزیم را تسهیل میکند استفاده شده است چون فعالیت و قابلیت بکارگیری مکرر و پایداری عملیاتی آن را افزایش میدهد.یکی از انواع مناسب حامل های نانو، ذرات کیتوسان میباشد که یک نوع پلیمر بیولوژیکی است لذا در این تحقیق خصوصیات سینتیکی آنزیم لیپاز آزاد و تثبیت شده برروی نانو ذره کیتوسان بررسی خواهد شد. 1-2-اهداف تحقیق :این تحقیق در نظر دارد با بکارگیری کیتوسان و تثبیت آنزیم لیپاز قابلیت امکان استفاده مکرر ازاین آنزیم را به وجود آورد لذا مهمترین اهداف تحقیق عبارتند از:1-مشخص کردن میزان فعالیت آنزیم لیپاز تثبیت شده در مقایسه با آنزیم لیپاز آزاد.2-استفاده از نانو ذره کیتوسان بعنوان بستر مناسب برای تثبیت آنزیم لیپاز بجای تثبیت آن بر روی پایه های متخلخل آلی که بازده کمتری در مقایسه با حامل های نانو دارند.3-استفاده مکرر و موثرتر آنزیم لیپاز و نیز کاهش هزینه های انجام فرآیند. 1-3- فرضیه های تحقیق:با توجه به اهداف متصور برای تحقیق حاضر و دستیابی به پاسخ های مناسب برای سوالات مطرح شده فرضیات زیر مورد توجه قرارخواهد گرفت:1-استفاده از آنزیم لیپاز تثبیت شده بر روی نانوذره کیتوسان خصوصیات سینیتیکی مناسب تری نسبت به آنزیم آزاد دارد.2-نانو کیتوسان بعنوان یکی از بهترین حامل های آلی برای تثبیت آنزیم به شمار می رود. 1-4- مفهوم نانوتکنولوژی[1]:نانوتكنولوژي مطالعه ذرات در مقياس اتمي براي كنترل آنهاست. هدف اصلي اكثر تحقيقات نانوتكنولوژي شكل‌دهي تركيبات جديد يا ايجاد تغييراتي در مواد موجود است. نانوتكنولوژي در الكترونيك، زيست‌شناسي، ژنتيك، هوانوردي و حتي در مطالعات انرژي بكار برده مي شود. نانوتکنولوژی به تولید مواد، قطعات و سیستم های مفید با کنترل آنها در مقیاس طولی نانومتر و بهره برداری از خصوصیات و پدیده های جدید حاصله در آن مقیاس گفته می شود [6].به عبارت دیگر نانو فناوری به تکنولوژی گفته می شود که کلیه فعالیت ها جهت ایجاد ساختاری ظریف در مقیاس نانو برای تغییر در تک تک اتمها و مولکولها را شامل میشود،به طوری که مواد و وسایل جدید با خواص مورد نظر و مطلوب قابل ساختن میشوند [7].بدین ترتیب ترکیباتی تولید میشوند که انتظار میرود در بازارهای آینده نقش کلیدی بازی کنند. تفاوت اصلی فناوری نانو با فناوری های دیگر در مقیاس مواد و ساختارهایی است که در این فناوری مورد استفاده قرار میگیرند. البته تنها کوچک بودن اندازه مد نظر نیست، بلکه زمانی که اندازه مواد در این مقیاس قرارمیگیرد، خصوصیات ذاتی آنها از جمله رنگ، استحکام و ... نیز تغییر مییابد[8]. 1-4-1-کاربردهای نانو تکنولوژی:امروزه فناوری نانو به طور شگفت آوری در تمامی علوم وارد شده و نقش تعیین کننده ای در مراحل مختلف تولید ایفا میکند که در زیربه طور مختصر به برخی کاربردهای آن اشاره میشود:1-4-1-1- تولید مواد و محصولات صنعتی: نانو تکنولوژی تغییر بنیانی مسیری است که در آینده، موجب ساخت مواد و ابزارها خواهد شد. امکان سنتز بلوک های ساختمانی نانو با اندازه و ترکیب به دقت کنترل شده و سپس چیدن آنها در ساختار بزرگتر، که دارای خواص منحصر به فرد باشند، انقلابی در مواد و فرآیندهای تولید آنها، ایجاد میکند. از مزایای نانوساختارها میتوان به سبکتر، قویتر و قابل برنامهریزی بودن آنها، کاهش هزینه عمر کاری آنها از طریق کاهش دفعات نقص فنی، ابزارهایی نوین بر پایه اصول و معماری جدید اشاره کرد ]9[.1-4-1-2- پزشكي و بدن انسان: رفتار مولكولي در مقياس نانومتر، سيستم هاي زنده را اداره ميكند. يعني مقیاسی که شیمی، فیزیک، زیستشناسی و شبیه سازی کامپیوتری، همگی به آن سمت در حال گرایش هستند ]10[.فراتر از سهولت استفاده بهینه از دارو، نانوتکنولوژی میتواند فرمولاسیون و مسیرهایی برای رهایش دارو، تهیه کند، که توان درمانی داروها را افزایش دهد ]11[.1-4-1-3- پایداری منابع: ميتوان به منابعي همچون كشاورزي، آب، انرژي، مواد و محيط زيست پاك اشاره کرد. گستردگی تعاملات بین این فناوری و علوم جانبی آنها، از ویژگیهای کاملا بارز این فناوری جدید است. تقسیمبندی فناوری نانو در شاخهها و رشتههای مختلف بیشتر مربوط به کاربرد محصولات این فناوری در هر رشته میباشد. در ضمینه مسائل زیست محیطی، غذایی، دارویی نیز استفاده از نانو اجتناب ناپذیر خواهد بود.1-4-1-4- صنایع غذایی: حوزههاي مختلف كاربردي فناوري نانو در غذا و صنايع غذايي را مي توان به پنج دسته زير تقسيم بندي نمود:الف- بهبود طعم و رنگ: به کمک فناوری نانو توانسته اند در مواد غذایی مختلف خواصی ایجاد کنند که ایجاد احساس طعم و بوی خاص در مصرف کننده میکند. مثلا تولید سس کم چربی که مزه چربی میدهد در حالی که چربی ندارد.