چکیدهمقدمه: بور ریز مغذی ضروری برای گیاهان است و مطالعات نشان داده که این عنصر می تواند به عنوان یک ریزمغذی برای حیوانات و انسان نیز محسوب شود. در این پژوهش به منظور درک بهتر از نقش بور، اثر دوزهای مختلف اسید بوریک بر توانایی حیات، تکثیر، تمایز و فاکتورهای بیوشیمیائی سلولهایبنیادی مزانشیم مغز استخوان رت (MSCs) مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها: MSCs تا سه پاساژ کشت و برای بررسی توان تکثیر و تمایز در محیطهای کشت فاقد ترکیبات استئوژنیک و واجد ترکیبات استئوژنیک آلوده به اسید بوریک قرار داده شد. در بخش اول که شامل بررسی توانائی تکثیر میشود، توانایی حیات با کمک تست MTT و تریپان بلو در زمانهای 12، 24و 36 ساعت بررسی و دوزهای 6 نانو، میکرو و میلیگرم بر میلیلیتر اسید بوریک و زمان 36 ساعت جهت انجام مطالعه انتخاب گردید. در ادامه، توانائی تکثیر با استفاده از توانایی تشکیل کلونی (CFA) و دو برابرشدگی جمعیتی(PDN)، مورفولوژی سلول ها توسط رنگ آمیزی فلوروسنس، سطح الکترولیتهای سدیم، پتاسیم با استفاده از فلیم فتومتر و میزان کلسیم، میزان فعالیت آنزیمهای LDH، ALP،AST و ALT توسط کیتهای تجاری ارزیابی شد. در بخش دوم که شامل بررسی توانائی تمایز میشود، تاثیر دوز 6 نانو و میکروگرم بر میلیلیتر به عنوان دوزهای منتخب در زمانهای 5، 10، 15 و 21 روز بر توانایی زیستی، مورفولوژی، سطح الکترولیتها و فعالیت آنزیم هایLDH ،AST و ALT در سلول ها تمایز یافته بررسی شد.میزان تمایز با استفاده از روش کمی آلیزارین رد، غلظت کلسیمو فعالیت آنزیم ALP مورد ارزیابی قرار گرفته و داده ها توسط روش آماری ANOVA، آزمون tukeyآنالیز و p<0/05 به عنوان سطح معنی دار در نظر گرفته شد. نتایج: نتایج بدست آمدهنشان داد که در سلول های مزانشیم میزان توانایی زیستی در دوز و زمان کم تغییر نمی کند، اما افزایش در هر دو فاکتور زمان و دوز، کاهش فعالیت آنزیمهای متابولیکی و متعاقبا حیات را بدنبال داشت. در سلولهای استئوژنیک فقط در دوز بالا و با گذشت زمان منجر به کاهش توانایی حیات سلولی شد و دوز 6 نانوگرم هیچ اثری بر روی توانایی حیات نشان نداد ضمنا فاکتورهای تمایزی، الکترولیتها و آنزیمهای متابولیکی با افزایش زمان فقط در دوز 6 نانوگرم افزایش یافت. نتیجه گیری: تاثیر اسید بوریک به نوع سلول و شرایط تیمار وابسته است به گونه ای که در این مطالعه نشان داده شد که حساسیت سلولهای مزانشیم نسبت به سلولهای استئوبلاست بیشتر است. علاوه بر این دوز پایین اسیدبوریک دارای تاثیر مثبتی بر روند تمایز استخوان بود، لذا دوزهای پایین اسید بوریک می تواند نقش مفیدی بر سلامت سلول های مزانشیم و تمایز آنها به استئوبلاست داشته باشد.-1 سلولهای بنیادی1-1-1 تعریف سلولهای بنیادیبه طور نرمال سلولهای تخصص یافته بدن مثل سلول پوست یا سلول عصبی در تمام دوره زندگی به همان صورت باقی میمانند، اما در بدن سلولهای دیگری به نام سلولهای بنیادی وجود دارند که توانایی تبدیل به سلولهای دیگری چون سلول قلب، عصبی، ماهیچه و ....... را دارا میباشند (1).سلولهای بنیادی[1] سلولهایی غیر تخصصی[2] در بدن هستند که قابلیت تمایز به سلولهای تخصصیافته را با کسب کلیه اعمال سلولی تخصصی دارند. این سلولها دارای دو ویژگی اساسی یعنی توانایی تقسیم و تولید سلولهایی با خواص یکسان(خودنوزایی)[3]و ایجاد انواع سلولهای تمایزیافته میباشند(شکل 1-1)(1).به دلیل اینکه این سلولها منشا تولید بقیه انواع سلولها هستند واژه بنیادی در مورد آنها به کار میرود به عبارت دیگر یک سلول بنیادی، سلولی است که به دلیل توانایی کسب کلیه اعمال تخصصی قابلیت تبدیل به سلولهای تخصص یافته را دارد. این سلولها جهت تمایز نیازمند دریافت سیگنال هستند. فصل اول: کلیات و هدف11-1 سلولهای بنیادی ............................................................................................................................................11-1- 1 تعریف سلولهای بنیادی.........................................................................................................................21-1-2 ویژگی خودنوزایی سلول بنیادی.............................................................................................................31-1-3 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس توان تمایزی آنها ................................................................41-1-4 دستهبندی سلولهای بنیادی بر اساس منشا ......................................................................................41-1-4-1 سلولهای بنیادی جنینی.....................................................................................................................61-1-4-2 سلول بنیادی خون بند ناف.................................................................................................................71-1-4-3 سلولهايبنیاديبزرگسالان.................................................................................................................101-1-5 سلولهای مغز استخوان ...........................................................................................................................101-1-5-1 سلولهای بنیادی خونساز....................................................................................................................111-1-5-2 سلول مزانشیم مغز استخوان...............................................................................................................121-2 تاریخچه سلول بنیادی مزانشیم ..................................................................................................................131-2-1 مورفولوژی سلول بنیادی مزانشیم ..........................................................................................................141-2-2 کنام سلول بنیادی مزانشیم مغز استخوان ...........................................................................................151-2-3 ویژگیهای اساسی سلول بنیادی مزانشیم ...........................................................................................161-3 کاربردهای سلول بنیادی مزانشیم در درمان ............................................................................................171-3-1 ترمیم استخوان ...........................................................................................................................................171-4 بافت استخوان .................................................................................................................................................201-5 استئوژنز(استخوانسازی) ..............................................................................................................................211-5-1 استخوانسازی اولیه یا جنینی ................................................................................................................231-5-2 استخوانسازی ثانویه ................................................................................................................................231-5-3 دوبارهسازی استخوان ................................................................................................................................241-6 هتروژن بودن کشت سلول بنیادی مزانشیمی ...........................................................................................251-6-1 شرایط آزمایشگاهی تمایز مزانشیم به استخوان ..................................................................................251-6-2 تنظیم مولکولی تمایز به استخوان سلولهای بنیادی مزانشیمی .....................................................271-6-3 نقش سیگنال دهی Wnt در تمایز سلول های بنیادی مزانشیم به استخوان ..............................291-7 عنصر بور ..........................................................................................................................................................301-7-1 مشتقات بور .................................................................................................................................................321-7-2 فراوانی عنصر بور ........................................................................................................................................321-7-3 تاریخچه مصرف بور ...................................................................................................................................331-7-4 منابع طبیعی بور..........................................................................................................................................341-7-5 اثرات بور برفلزات ضروری برای متابولیزم در جانوران .......................................................................341-7-5-1تاثیربوربرفیزیولوژیبدن ................................................................................................................361-7-5-2 تاثیر بور بر روی سرین پروتئازها .......................................................................................................371-7-6 کاربرد بور در دارو .....................................................................................................................................371-7-7 سرطان .........................................................................................................................................................391-8 اثرات بور روی استخوان ................................................................................................................................401-9 بور و خون .........................................................................................................................................................411-10 بور در گیاهان ................................................................................................................................................421-11 سمیت بور ......................................................................................................................................................441-12 محدوده استفاده بور .....................................................................................................................................45مروری بر مطالعات گذشته .....................................................................................................................................47هدف مطالعه .............................................................................................................................................................فصل دوم: مواد و روشها502-1 انتخاب رت......................................................................................................................................................502-2 جدا سازی وتكثير سلولهای بنیادی مزانشیم مغز استخوان ................................................................522-2-1 اجرای پاساژ ................................................................................................................................................542-3 اثبات مزانشیم بودن سلول های استخراج شده ........................................................................................542-3-1 تمایز به استخوان ......................................................................................................................................552-4 بررسی توان زیستي سلولها (دوز فايندينگ) .............................................................................................552-4-1 رنگآمیزیتریپانبلو .............................................................................................................................572-4-2 سنجشتترازولیوم (MTT) ...................................................................................................................572-4-2-1مراحلانجامسنجشMTT)غیراستئوژنیک( .............................................................................582-4-2-2 ترسیممنحنیاستانداردبااستفادهازسنجشتترازولیوم .........................................................592-4-2-3 مراحلانجامتستMTT استئوژنیک ............................................................................................602-5 انتخابدوزموردنظر ...................................................................................................................................602-6 بررسی توان تکثیری سلولهای بنیادی مزانشیم .....................................................................................612-6-1 سنجش توانایی کلونیزایی .......................................................................................................................632-6-2 محاسبه تعداد دوبرابرشدگی جمعیتی(PDN) ...................................................................................622-7 بررسي تغییرات مورفولوژیکی با استفاده از رنگ آميزي فلوروسنت .....................................................652-8 آزمونهای بیوشیمیایی در شرایط تمایز و غیرتمایزی ............................................................................652-8-1تیمار و استخراج عصاره سلولی .................................................................................................................652-8-2 بررسی فعالیت آنزیمها ..............................................................................................................................662-8-2-1تهیهینموداراستانداردبرایآزمایشلاوری ...............................................................................662-8-2-2 ترانس آمینازها .....................................................................................................................................682-8-2-3 لاکتات دهیدروژناز................................................................................................................................702-8-2-4 آنزیم آلکالین فسفاتاز ...........................................................................................................................722-8-3 سنجشميزانرسوبماتريكسمعدنيبهكمكرنگآليزارينرد در سلول های استئوژنیک722-8-3-1 رسممنحنیاستانداردبرایرنگآمیزیآلیزارینرد .................................................................732-8-3-2 بررسیرسوبماتریکساستخوانیدرنمونههایتیمارشده ...................................................732-8-4 بررسیالکترولیتها )کلسیم،سدیموپتاسیم( ...............................................................................732-8-4-1بررسیمیزانکلسیمداخلسلولیبااستفادهازکیتکلسیمبهروشرنگسنجی ............742-8-4-1-1 مراحل انجامتستکلسیمدرسلولهایتمایزیافته )استئوبلاست( ................................752-8-4-1-2مراحلانجاماندازهگیریمیزانکلسیم ......................................................................................762-8-4-2اندازهگیریغلظتسدیموپتاسیمسلولاستئوژنیکوغیراستئوژنیک ................................812-9 تجزیه و تحلیل آماری داده ها ......................................................................................................................فصل سوم: نتایج823-1 الف:نتایجمرحلهاول ....................................................................................................................................823-1-1 رشدوتکثیرسلولهایبنیادیمزانشیم ..............................................................................................823-1-2 اثراسیدبوریکبرتواناییزیستیسلولهایبنیادیمزانشیممغزاستخوانرت ........................853-1-3 بررسیمورفولوژیسلولهایتیمارشده ...............................................................................................873-1-4 نتایجتواناییکلونی زایی،تعداددوبرابرشدگیجمعیتسلول .....................................................893-1-5 اثراسیدبوریکبرفاکتورهایبیوشیمیایی ........................................................................................913-1-6 میزانالکترولیتها.......................................................................................................................................923-2 نتایجاثردوزهایانتخابیاسیدبوریکبرشاخصهایتمایزبهاستئوبلاست ................................923-2-1 تواناییزیستیسلولهادرروندتمایز .....................................................................................................933-2-2 بررسیتغییراتمورفولوژیکیبااستفادهازرنگآمیزیفلورسنتدرنمونههای استئوژنیک963-2-3بررسیاثراسیدبوریکبرفاکتورهایبیوشیمیاییسلولهایتمایزیافته ......................................973-2-3-1 میزانمعدنیشدنماتریکسباسنجشرنگآلیزارین رد ........................................................1003-2-3-2 میزانرسوبکلسیم ..........................................................................................................................1013-2-3-3 بررسیفعالیتآنزیمآلکالینفسفاتاز .............................................................................................1013-2-3-2 بررسیفعالیتآنزیمآسپارتاتوآلانینترانسآمیناز .................................................................1033-2-3-5 بررسیفعالیتلاکتاتدهیدروژناز ..................................................................................................1033-2-3-6 بررسیسطحالکترولیتهایسلولهایاستئوژنیک .....................................................................فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری1054-3اثراسیدبوریکبرسلولهایمزانشیم ...........................................................................................................1054-1-1اثراسیدبوریکبرتواناییزیستیوتوانتکثیرسلولها ......................................................................1084-1-2 بررسیتاثیراسیدبوریکبرتغییراتمورفولوژیکی ...........................................................................1094-1-3 اثراسیدبوریکبرفاکتورهایبیوشیمیایی ..........................................................................................1134-1-4 اثراسیدبوریکبرفعالیتآنزیمهایمتابولیکی ................................................................................1164-2 اثراسیدبوریکبرتمایزسلولی ..................................................................................................................1164-2-1 تواناییزیستی ............................................................................................................................................1194-2-2 بررسیسطحالکترولیتها ......................................................................................................................1204-2-3 بررسیفاکتورهایاستئوژنیک ...............................................................................................................1244-2-4 بررسیاثراسیدبوریکبرآنزیمهایمتابولیکی ...............................................................................1274-2-5 تاثیراسیدبوریکبرمورفولوژیسلولهایتمایزی ............................................................................1284-3 نتیجهگیری ...................................................................................................................................................1294-4 پیشنهادات ........................................................................................................................................................فصل پنجم:ضمیمه1315-1روشتهیهمحیطکشت ...............................................................................................................................1315-2 تهیهیفسفاتبافرسالینPBS-...........................................................................................................1325-3 تهیهیفسفاتبافرسالینمثبتPBS+..................................................................................................1325-4 روشتهیهمحیطتمایزیاستئوژنیک ........................................................................................................1335-5 آمادهسازیآلیزارینرد ...............................................................................................................................1335-6 روش تهیه محلول تریپانبلو 4/0 درصد ...................................................................................................1335-7 تهیهکریستالویولت ....................................................................................................................................1335-8 روش تهیه محلول MTT...........................................................................................................................1335-9 روشتهیهبافرشستوشو( ( Tris-Hcl-NaCl..............................................................................1335-10 مواد لازم و روش تهیه بافر استخراج ( Tris-Hcl) ...........................................................................1345-11 روش تهیه بافر ARS .................................................................................................................................1345-12 روش تهیه محلول BSA ...........................................................................................................................1345-13 روشتهیهمحلولکمپلکسلاوری ......................................................................................................1355-14 روشتهیهبافراستخراجکلسیم .............................................................................................................1355-15 روشتهیهرنگهایفلورسنسهوخستوآکریدیناورنژ ................................................................ فهرست اشکال2شکل1-1:توانائی خودنوزائی و پتانسیل تمایز در سلولهای بنیادی ..............................................................4شکل 1-2: دستهبندی سلولهای بنیادی براساس پتانسیل تمایزی آنها ....................................................5شکل 1-3: تصویر شماتیک از سلولهای بنیادی جنینی ...............................................................................6شکل 1-4: نمایی از بند ناف و ژله وارتون ..........................................................................................................11شکل 1-5: سلول بنیادی خونساز ......................................................................................................................13شکل 1-6: عملکردهای اصلی سلول بنیادی مزانشیم .....................................................................................14شکل1-7: مورفولوژی فیبروبلاستی سلولهای بنیادی مزانشیمال از مغز استخوان ..................................15شکل 1-8: کنام سلولهای بنیادی مغز استخوان .............................................................................................16شکل 1-9: کاربرد سلول بنیادی مزانشیم در درمان ........................................................................................17شکل1-10: استفاده از سلول بنیادی مزانشیم در ترمیم جراحات استخوان ..............................................18شکل1-11: ساختمان استخوان ...........................................................................................................................19شکل1-12: منشا سلولهای تشکیل دهنده استخوان .....................................................................................22شکل 1-13: فرآیند استخوانی شدن درون غضروفی .......................................................................................22شکل 1-14: استخوانسازی درون‌غشایی ...........................................................................................................24شکل1-15: دوبارهسازی استخوان، جذب استخوان .........................................................................................26شکل1-16: مراحل فرآیند استئوژنیک و ژنهای کنترلی آن ...........................................................................27شکل1-17: تصویر شماتیک از مسیر سیگنال دهی Wnt ............................................................................29شکل 1-18: جایگاه بور در جدول تناوبی عناصر ..............................................................................................30شکل 1-19: اسید بوریک .....................................................................................................................................35شکل 1-20: کمپلکس دی آدنوزین فسفات با بور ...........................................................................................36شکل 1-21 : میانکنش بور با جایکاه فعال آنزیم سرین پروتئاز ....................................................................37شکل1- 22: آنتی بیوتیک تارترولون ...................................................................................................................39شکل1- 23: Bortezomib ...............................................................................................................................42شکل 1-24: شکلگیری کمپلکس رامنوگالاکتورونات در دیواره سلولی گیاهان ........................................51شکل 2-1: انجام فلش اوت مغز استخوان ..........................................................................................................52شکل 2-2نحوه قرار دادن فلاسک به انکوباتور .................................................................................................53شکل 2-3: لام نئوبار ..............................................................................................................................................55شکل 2-4: ساختار آلیزارین رد ............................................................................................................................55شکل 2-5: ماتریکس استخوانی رنگ آمیزی شده با آلیزارین رد...................................................................56شکل 2-6: ساختار تریپان بلو ..............................................................................................................................57شکل 2-7: تغییر رنگ MTT بر اثر آنزیمهای میتوکندریایی و تولید بلور فورمازان ..............................58شکل 2-8: دستگاه ELISAREADER .....................................................................................................59شکل 2-9: نمودار استاندارد MTT ....................................................................................................................61شکل 2-10: توانایی تشکیل کلونی (CFA) .....................................................................................................61شکل 2-11: ساختمان کریستال ویولت .............................................................................................................64شکل 2-12: میکروسکوپ فلورسانس المپوس .................................................................................................64شکل 2-13: ساختار رنگ فلورسنس هوخست .................................................................................................64شکل 2-14: ساختار رنگ فلورسنت آکریدین اورنژ .........................................................................................66شکل 2-15: نمودار استاندارد لاوری ...................................................................................................................67شکل 2-16: آسپارتات آمینوترانسآمیناز ...........................................................................................................67شکل 2-17 آلانین ترانس آمیناز...........................................................................................................................68شکل2-18 کیت های آنزیمیALT، AST و ALP ...................................................................................69شکل2-19 : لاکتات دهیدروژناز ..........................................................................................................................شکل 2-20: منحنیاستانداردآنزیمهایاکسیدوردوکتاز................................................................70شکل 2-21: آلکالین فسفاتاز..................................................................................................................................72شکل 2-22: غلظتهایمشخصمورداستفادهدررسممنحنیاستاندارد ...............................................72شکل 2-23: نمودار غلظت های مشخص از رنگ آلیزارین رد .......................................................................76شکل 2-24: دستگاه اسپکتوفتومتر ....................................................................................................................77شکل2-25 : نمای شماتیک دستگاه فلیم فتومتر ............................................................................................78شکل2-26: دستگاه فلیم فتومتر ........................................................................................................................79شکل2-27: نمودار استاندار سدیم .......................................................................................................................79شکل2-28: نمودار استاندارد پتاسیم ...................................................................................................................83شكل3-1. مراحل رشد سلول‌هاي بنيادي مزانشيم طي پاساژ‌هاي مختلف ................................................86شکل 3-2. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های با فلورسنس رنگ هوخست ................................................87شکل 3-3. رنگ آمیزی سلول بنیادی مزانشیم تمایزیافته با رنگ آکریدین اورنژ .................................88شکل 3-4: تصاویر میکروسکوپی و ماکروسکوپی کلونی های تشکیل شده ................................................95شکل 3-5 رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایزیافته با فلورسنس رنگ هوخست ................96شکل 3-6. رنگ آمیزی فلورسنت سلول های بنیادی تمایز یافته با فلورسنس رنگ آکریدین اورنژ98شکل 3-7A:تصاویر ماکروسکوپی ماتریکسهای رنگآمیزی شده با آلیزارین رد ......................................99شکل 3-7B: تصاویر میکروسکوپی ماتریکسهای رنگآمیزی شده با آلیزارین رد ....................................115شکل 4-1: نمایشماتیکتغییراتبیوشیمیائیاحتمالیدرروندکاهشمتابولیزمگلوکز.............. فهرست جداولجدول1-1: سلولهای مشتق شده از سلولهای خونساز و مزانشیم مغز استخوان .........................12جدول1- 2: منابع طبیعی بور ..............................................................................................................................33جدول1- 3: غلظت بور در بافت های مختلف ...................................................................................................43جدول1-4: وابستگی جذب بور به جنس و وزن ...............................................................................................44جدول 3-1 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول ها با رنگآمیزی تریپانبلو ......................................84جدول 3-2 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول با تست MTT .............................................................85جدول3-3 مقایسه میانگین قطر هسته و مساحت سیتوپلاسم سلو لهای بنیادی مزانشیم..........87جدول3-4 مقایسه میانگین تعداد و قطر کلونی های تشکیل شده توسط سلولهای مزانشیم..........89جدول 3-5 مقایسه میانگین تعداد دوبرابرشدگی جمعیت سلول های بنیادی مزانشیم ....................89جدول 3-6 مقایسه میانگین فعالیت (IU/L) آنزیم های (AST)، (ALT)، (LDH) و (ALP) سلولهای بنیادی مزانشیم ....................................................................................................................................91جدول 3-7 مقایسه میانگین میزان کلسیم، سدیم و پتاسیم داخل سلولی مزانشیم ................................92جدول 3-8 مقایسه میانگین توانایی زیستی سلول های استئوژنیک با تست MTT ..............................93جدول 3-9 مقایسه میانگین قطر هسته (میکرومتر) سلو لهای استئوژنیک ...............................................94جدول 3-10 مقایسه میانگین مساحت سیتوپلاسم سلو لهای استئوژنیک ................................................94جدول 3-11 مقایسه میانگین میزان رنگ (میلیگرم) آلیزارین رد استخراج شده از سلول های استئوژنیک97جدول 3-12 مقایسه میانگین میزان کلسیم (میلیگرم بر دسیلیتر) در نمونههای استئوژنیک100جدول 3-13 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALP (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ...............101جدول 3-14 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم AST (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ..............102مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم ALT (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ........................................102جدول 3-16 مقایسه میانگین میزان فعالیت آنزیم LDH (IU/L)در نمونه های استئوژنیک ..............103جدول 3-17 مقایسه میانگین میزان سدیم در نمونه های استئوژنیک .......................................................104جدول 3-18مقایسه میانگین میزان پتاسیم در نمونه های استئوژنیک ......................................................104