ليستريامونوسايتوژنز باكتريگرممثبت،هوازيتابيهوازياختياريوميلهايشكلاستكهباعثبيماريليستريوزيسدرانسان و حیواناتميشود.ليستريامونوسايتوژنز یکی ازمهم ترین پاتوژن های غذا زاد محسوب می گردد.هدف از انجام این مطالعه بررسی اثرات بازدارندگی تیمول، نایسین و اسید لاکتیک به تنهایی و بصورت ترکیب با یکدیگر بر باکتری لیستریا مونوسایتوژنز تلقیح شده به قطعات مرغ درغلظت هايپايينترازحداقلغلظتمهاركنندگي می باشد. به این منظور 48 نمونه در 8 گروه برای بررسی اثرتیمول با غلظت mg/ml04/0، نایسین/ml gμ6، اسید لاکتیک 2% و حالت های ترکیبی آن ها طی دوره ی هفت روزه نگهداری در یخچال مورد آزمایش قرار گرفت. تعداد باکتری ها در روزهای صفر، سه و هفت شمارش گردید. نتایج با استفاده از آزمون آماریRepeated measure ANOVA مورد ارزیابی قرار گرفت. میانگین تعداد باکتری در دوره 7 روزه بین گروه ها تفاوت معنی داری داشت (p<0.001).میانگین لگاریتم تعداد باکتری در دوره 7 روزه در تمام گروه ها به جز نایسین به صورت معنی داری کمتر از گروه کنترل بود. مطالعه ی حاضر نشان داد بیشترین اثر مهارکنندگی به ترتیب مربوط به گروه اسید لاکتیک و ترکیب دوتایی (نایسین+اسید) و گروه ترکیب سه تایی (نایسین+اسید لاکتیک+تیمول) بود.نایسین به تنهایی اثر معنی داری در کاهشجمعیت باکتری نسبت به گروه کنترل نداشت و کمترین اثر را نسبت به گروه اسید لاکتیک و گروه تیمول داشت. تیمول به تنهایی اثر کمتری نسبت به حالت های ترکیبی با اسید و اثر بیشتری نسبت به حالت ترکیبی با نایسین ازخود نشان داد.نتایج این مطالعه نشانگر تاثیر مناسب اسید لاکتیک و ترکیبات دوتایی آن با نایسین و تیمول و ترکیب سه تایی نایسین، تیمول و اسید لاکتیک بر مهار رشد باکتری لیستریا مونوسایتوژنز است.کلمات کلیدی: لیستریا مونوسایتوژنز، تیمول، نایسین، اسید لاکتیک فهرست مطالب اثر تیمول، نایسین و اسید لاکتیک بر روی لیستریا مونوسایتوژنز تلقیح شده به قطعات مرغ مقدمه ....................................................................................................1فصل اول: مروری بر تحقیقات انجام شده1-1- لیستریا. 31-1-1-رده بندی لیستریا. 31-1-2- گونه های لیستریا. 41-1-3-سروتایپ ها. 41-1-4- طبقه بندی زیرگونه ها. 51-1-5-رشد. 51-1-6- اثرpH.. 61-1-7- اثر دما. 71-1-8- اثر فعالیت آبی. 71-1-9- انتشار در محیط. 81-1-10- انتشار در مواد غذایی و انسان. 81-1-11- شیوع. 81-1-12- ویژگی های بیماری زایی. 91-1-13- لیستریولازین o. 91-1-14- تهاجم درون سلولی. 101-1-15- فعالیت تولید مونوسیت. 111-2- بیماری لیستریوزیس. 121-2-1- شیوع. 121-2-2- منشاٴ ارگانیسم های بیماری زا. 131-2-3- بیماری. 131-3- مقاومت لیستریا مونوسایتوژنز در مواد غذایی. 151-4- محدودیت های قانونی لیستریا مونوسایتوژنز در مواد غذایی 151-5- نگهداری مواد غذایی با استفاده از دماهای پایین 161-6- نگهداری مواد غذایی با استفاده از نگهدارنده های شیمیایی 171-6-1-اسید های آلی. 181-6-2-اسید لاکتیک. 181-6-3- نایسین. 191-7- اسانس. 211-7-1- تیمول. 221-8- مروری بر تحقیقات انجام شده. 24 2- فصل دوم: مواد و روش‌ها2-1-تعیینMIC نایسین و تیمول. 332-2- آماده سازی وسایل. 342-3-تهیه ی سوسپانسیون باکتری. 342-4-ضدعفونی کردن قطعات مرغ. 352-5- تلقیح باکتری به نمونه ها. 362-6- تیمار نمونه ها. 362-7- آنالیز آماری. 383- فصل سوم: نتایج3-1- توصیف رشد باکتری لیستریا مونوسایتوژنز تحت تاثیر اسید لاکتیک، نایسین، تیمول و حالتهای ترکیبی آنها در دوره ی مطالعه 403-2- مقایسه ی میانگین لگاریتم تعداد باکتری بین گروه های مختلف در دوره ی مطالعه. 434- فصل چهارم: بحث و نتیجهگیری4-1- بحث. 484-2- نتیجه گیری و پیشنهادات. 60منابع و مراجع. 61 فهرست جدولها عنوان و شماره صحفهـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــجدول شماره 3- 1: جدول میانگین، انحراف معیار، مینیمم وماکزیمم لگاریم تعداد باکتری در گروه کنترل، اسیدلاکتیک، نایسین و تیمول 41جدول شماره 3- 2: جدول میانگین، انحراف معیار، مینیمم و ماکزیمم تعداد باکتری در حالتهای ترکیبی و کل گروههای مورد مطالعه 42جدول شماره 3- 3: مقایسه میزان کاهش لگاریتم تعداد باکتری در گروههای مختلف مورد مطالعه. 45 فهرست تصاویر عنوان و شماره صحفهـــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــــتصویر شماره 1- 1: ساختار شیمیایی اسید لاکتیک. 19تصویر شماره 1- 2: فرمول ساختمانی نایسین. 21تصویر شماره 1- 3: ساختار شیمیایی تیمول. 23تصویر شماره 2- 1: دستگاه بگ میکسر. 37تصویر شماره 2- 2: رشد باکتری لیستریا مونوسایتوژنز روی محیط کشت Palcam.. 37تصویر شماره 3- 1: نمودارمیانگین لگاریتم تعداد باکتری در گروه های مختلف. 46 گوشتطیوریکیازمساعدترینموادغذاییبرايرشدباکتری هايپاتوژنمیباشدکهبهعلتنحوهخاصکشتاروعملآوريگوشت درمعرضآلودگیقرارمیگیرد.اکثرمراحلکشتار، درکشتارگاهطیوررامیتوانبهعنوانمراحلیمحسوبکردکهبالقوهمیتوانندلاشههاراآلودهکنند. سردکردنلاشههايطیوردرمراحلآخرزنجیرهکشتار، یکیازفاکتورهايمهمحفظونگهداريکیفیتگوشتمرغبهحسابمیآید(1).باکتری لیستریامونوسایتوژنز[1] کوکوباسیل، گرم مثبت غیرهاگ زا می باشد. میزان و پراکندگی این باکتری در طبیعت زیاد است. این باکتری در انسان و حیوان بیماری زا است و عوارض مختلفی را ایجاد می کند. راه اصلی انتقال این باکتری به انسان از طریق مصرف غذاهای آلوده است. گوشت مرغ و ماهی دو منبع غذایی اصلی و مهم برای انسان به شمار می رود(2).به منظور ماندگاری طولانی تر غذا ها و جلوگیری از رشد باکتری ها، از نگهدارنده های شیمیایی استفاده می گردد. اما امروزه بر استفاده کمتر از این روش ها تاکید می شود زیرا از یک سو مصرف کنندگان مواد غذایی خواستار غذاهای طبیعی با ماندگاری طولانی، همراه با کمترین تغییر در ساختار آن می باشند و از سوی دیگر خاصیت سرطان زایی و سمی بودن برخی از نگهدارنده های شیمیایی نیز برای انسان به اثبات رسیده است. از این رو فشار بر روی صنایع غذایی برای جایگزینی سریع نگهدارنده های شیمیایی و استفاده از نگهدارنده های طبیعی یکی از رویکرد های جدید در جهت ارتقاء سلامت غذا ها و به دنبال آن افزایش سطح سلامت عمومی جوامع می باشد(3). «فصل اول»مروری بر تحقیقات انجام شده 1- فصل اول کلیات و مروری بر تحقیقات انجام شده 1-1-لیستریا 1-1-1- رده بندی لیستریا لیستریا باکتری گرم مثبت، فاقد توانایی تشکیل اسپور و میله ای غیر اسید فست[2] است که زمانی به عنوان(لیسترلا)[3]طبقه بندی شده بود. نام جنس آن در سال 1940 به لیستریا تغییر یافت. کلنی های لیستریارنگ سبز-آبی براقی را زیر نور مورب نشان می دهند. اسیدهای تیکوئیک[4] نوع پلی (ریبیتول فسفات)[5] از ترکیب متداول یا تنها پلیمر ضمیمه ی دیواره ی سلولی گونه های لیستریا می باشند. لیپوتیکوئیک[6] اسید لیستریا گرایی[7]از نوع تغییر یافته می باشد که باعث تفکیک آن از گونه های دیگر می شود. اگرچه گونه های لیستریا معمولا کاتالاز تولید می کنند، اما سویه های کاتالاز منفی لیستریامونوسایتوژنزاز مواد غذایی جداسازی شده اند. تستCAMP[8] به عنوان آزمایشی قطعی جهت لیستریا مونوسایتوژنز مورد توجه افراد زیادی قرار گرفته است(4). 1-1-2-گونه های لیستریا شش گونه ی لیستریا عبارتند از: لیستریا مونوسایتوژنز، لیستریا اینوکوا[9]، لیستریا سیلیجری[10]، لیستریا ولشیمری[11]، لیستریا ایوانووی[12]، لیستریا گرایی، لیستریا مورایی[13] و لیستریا گرایی با هم در یک گروه قرار گرفته اند(4). 1-1-3-سروتایپ ها شش گونه ی لیستریا با داشتن آنتی ژن هایی که به 17 واریته ی سرولوژیکی تقسیم شده اند، شناخته می شوند. گونه ی بیماری زا یعنی لیستریا مونوسایتوژنز، از طریق 13 واریته ی سرولوژیکی مشخص می گردد و برخی از آن ها در لیستریا اینوکوآو لیستریا سیلیجری نیز وجود دارند. اگرچه لیستریا اینوکوآ تنها دارای 3 واریته ی سرولوژیکی می باشد، ولی این باکتری گاهی اوقات به عنوان واریته ی غیر بیماریزایی از لیستریا مونوسایتوژنز به حساب می آید. متداول ترین سروتایپ های جداشده انواع 1و4می باشند(4). 1-1-4-طبقه بندی زیرگونه ها علاوه بر تقسیم بندی سرولوژیکی، روش های دیگری برای شناسایی گونه ها و زیرگونه های لیستریامونوسایتژنز به کار رفته است. این روش ها عبارتند از : تقسیم بندی بر اساسباکتریوفاژ، الکتروفورز آنزیمی چند منطقه ای (MEE)[14]، آنالیز آنزیم محدودکننده (REA)[15]، ژل الکتروفورز با بستر پالسی (PFGE)[16]، چند شکلی بودن قطعات محدودکننده (RFLP)[17] و ریبوتایپینگ[18](4). 1-1-5-رشد احتیاجات غذایی لیستریا شاخصی از ترکیباتی است که برای دیگر باکتری های گرم مثبت لازم است. آن ها به خوبی در بسیاری از محیط کشت های معمول مانند : برین هارت اینفیوژن[19]، تريپتيكازسوي[20] و تريپتوز براث[21] رشد می کنند.حداقل چهار ویتامین گروه B (بیوتین، ریبوفلاوین، تیامین و اسید تیوکتیک) برای این باکتری ضروری است. همچنین اسید آمینه های سیستئین، گلوتامین، ایزولوسین و والین نیز برای رشد لازم می باشند. گلوكز رشد تمامی گونه‌ها را تقویتمی نماید. تمامی گونه‌ها گلوكز را از طريق مسير امبدان- ميرهوف[22] مصرف می کنند و برخی از گونه های لیستریا کربوهیدرات های مختلف ساده و کمپلکس دیگری را نیز به مصرف می رسانند و برخی از گونه های لیستریا همانند اکثر انتروکوکسی ها قادر به هیدرولیز اسکولین، رشد در غلظت 10 درصد یا 40 درصد (w/v) نمک های صفراوی، رشد درغلظت حدود 10 درصد NaCl، 25/0 درصد استات تالوس و 04/0 درصد تلوريت پتاسيم می باشند اما بر خلاف انتروکوکسی ها نمی توانند در حضور غلظت 02/0 درصد سدیم آزید رشد کنند. بر خلاف سایر باکتری های گرم مثبت، این باکتری ها قادرند در محیط کشت مک کانگی آگار[23]رشد نمایند. اگرچه آهن برای رشد این باکتری در محیط درون تنی [24]مهم است، ولی لیستریا مونوسایتوژنز به ظاهر دارای ترکیبات متصل به آهن نمی باشد و احتیاجات خود را از احیای آهن آزاد که به سطح گیرنده متصل می باشد، برآورده می سازد(4). 1-1-6- اثرpH با اینکه بهترین رشد لیستریا در دامنه ی pH معادل 8-6 صورت می گیرد، حداقل pH، که اجازه ی رشد و زنده ماندن را به این باکتری می دهد موضوع بسیاری از مطالعات بوده است. اکثر پژوهش ها در مورد سویه های لیستریا مونوسایتوژنز انجام گرفته است ولی اینکه آیا نتایج به دست آمده برای دیگر گونه های لیستریا نیز صدق می کند تنها در حد فرضیه است. به طور معمول برخی از گونه ها و یا سویه ها در دامنه pH 1/4 تا حدود6/9 و دامنه ی حرارتی C˚1 تا حدود C˚45 قادر به رشد می باشند. به طور معمول حداقل pH رشد یک باکتری تابعی از درجه ی حرارت گرمخانه گذاری، ترکیب غذایی سوبسترای رشد، aw، حضور و مقدارNaCl و سایر نمک ها یا بازدارنده ها می باشد(4). 1-1-7-اثر دما میانگین حداقل دمای رشد در محیط کشت تریپتیکاز سوی آگار برای 78 سویه از لیستریا مونو سایتوژنزC˚3/0 1/1، با دامنه ا‌ي از C˚3-5/0مي‌باشد. با توجه به آنکه حداقل دمای رشد سویه های لیستریا مونوسایتوژنز حدود C˚6/0 کمتر از سایر گونه ها می باشد، حدس زده می شود که همولیزین ممکن است رشد و بقای لیستریا مونوسایتوژنز را در محیط های سرد افزایش دهد. اگرچه رشد واریته های سرولوژیکی 4b, 1/2b, 1/2aدر حدود C˚3 پایین تر از واریته های سرولوژیکی می باشد که آنتی ژن های0I دارند. حداکثر دمای رشد برای لیستریا در حدود C˚45 می باشد(4).با توجه به این که این میکروارگانیسم قادر است در سرما رشد کند، ممکن است مواد غذایی داخل یخچال را آلوده کرده و یک خطر مهم برای سلامتی انسان محسوب می شود(5). 1-1-8-اثر فعالیت آبی لیستریا مونوسایتوژنز صرفا پس از استافیلوکوکسی ها به عنوان دومین بیماریزای غذایی است که قادر به رشد در مقادیرaw کمتر از 93/0 می باشد(4). 1-1-9-انتشار در محیط لیستریا به طور وسیعی در طبیعت انتشار دارد و روی گیاهان پوسیده، در خاک، مدفوع حیوانات، فاضلاب، علوفه و آب یافت می شود. لیستریا مونوسایتوژنز در علوفه ی تخمیری با pH بالاتر از 5/4 مشاهده شده است. بقای این ارگانیسم در خاک های مرطوب به مدت 295 روز یا بیشتر مشاهده شده است(4).