![مقاله104-بررسی پتانسیل ریزازدیادی و باززایی در تعدادي از ارقام زراعی و گونه های یکساله یونجه - رشته کشاورزی زراعت70ص](http://kialink.ir/img_project/19472_1493730414.jpg)
فهرست مطالبعنوان صفحه فصل اول: كلياتمقدمه ... 21-1- تاريخچه و خصوصيات گياه شناسي يونجه...... ..31-1-1- اهميت و گياهشناسي يونجه.. ...31-1-2- ژنتيك و گروههاي مختلف يونجه....... ....31-1-3- انواع یونجه زراعی داخلی... ...41-2- اهمیت كشت بافت....... ...41-3- کشت بافت گیاهی ........ ...51- 4- تاريخچه کشت بافت يونجه.... ...7 فصل دوم: بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق2-1- باززايي درون شيشهاي..... ... 102-1-1- باززايي مستقيم در یونجه..... .102-1-2- باززايي غيرمستقيم در یونجه...... ..13 فصل سوم: روش تحقیق3-1- رقم مورداستفاده....... ..243-2- محيط کشت، ترکيبات و آماده سازي آن........ ...243-2-1- محلولهاي ذخيره مواد معدني برای تهیه محیط کشتSH .....343-2-2- محلول هاي ذخيره مواد تنظیم کننده رشد.. ....253-3- شرايط كشت، ضد عفونی بذر و کشت ریزنمونهها........ .263-3-1- باززايي مستقيم از گره ساقه.... ...263-3-2- سازگاری گياهچهها........ 283-4- باززايي غيرمستقيم .........3- 5- روش و ابزار گردآوري اطلاعات..................................................................................................................................................................................303-6- روش آماري و تجزيه دادهها.........................................................................................................................................................................................30 فصل چهارم: تجزیه و تحلیل اطلاعات4-1- القاء جوانه و باززایی .....................................................................................................................................................................................................324-1-1- القاء جوانه در محیط کشت SIM I......................................................................................................................................................................324-1-2- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM I...........................................................................................................................................................354-1-3- القاء جوانه در محیط کشت SIM II....................................................................................................................................................................374-1-4- باززایی شاخساره در محیط کشتSIM II ........................................................................................................................................................404-1-5- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه چندساله و یکساله در القاء جوانه و باززايي شاخساره در محيط كشت SIM I....................................434-1-5-1- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجههاي چندساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM I...........................................................................434-1-5-2- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجههاي یکساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM I..............................................................................434-1-5-3- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه چندساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM I.......................................................................444-1-5-4- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه یکساله در باززایی شاخساره در محيط كشت SIM I..........................................................................454-1-6- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه چندساله و یکساله در القاء جوانه و باززايي شاخساره در محيط كشتSIM II....................................454-1-6-1- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه چندساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM II..................................................................................454-1-6-2- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه يكساله در القاء جوانه در محيط كشت SIM II.....................................................................................464-1-6-3- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه چندساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM II.....................................................................474-1-6-4- اثر ژنوتيپهاي مختلف يونجه يكساله در باززايي شاخساره در محيط كشت SIM II.........................................................................474-2- ریشهزایی........................................................................................................................................................................................................................484-2-1- ايجاد ريشه در يونجههاي چندساله......................................................................................................................................................................484-2-2- درصد ايجاد ريشه در يونجههاي چندساله..........................................................................................................................................................484-2-3- درصد ايجاد ريشه در يونجههاي يكساله..............................................................................................................................................................504-3- سازگاري و انتقال به شرايط گلخانه...........................................................................................................................................................................504-4- القاء كالوس در یونجههای چندساله و یکساله.........................................................................................................................................................514-4-1- باززايي غيرمستقيم از كالوس يونجه.....................................................................................................................................................................52 فصل پنجم: نتیجه گیری و پیشنهادات5-1- يونجههاي چندساله.......................................................................................................................................................................................................555-1-1- باززايي مستقيم ........................................................................................................................................................................................................555-1-1-1- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................555-1-1-2- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3.........................................................................................................565-2- يونجههاي يكساله..........................................................................................................................................................................................................565-2-1- باززايي مستقيم ........................................................................................................................................................................................................565-2-1-1- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر سطوح مختلف BAP و NAA ..............................................................................................565-2-1-2- القاء جوانه و باززايي شاخساره تحت تاثیر TDZ همراه با AgNO3...........................................................................................................575-3- باززايي غير مستقيم در يونجههاي چندساله و یکساله..........................................................................................................................................595-4- نتيجه گيري و پيشنهادات...........................................................................................................................................................................................60فهرست منابع و ماخذ.............................................................................................................................................................................................................61چکیده انگلیسی.......................................................................................................................................................................................................................67 فهرست جداولعنوان صفحه جدول 3- 1- ترکيب محلولهاي ذخيره (50×) پنجگروه نمکي غير آلي فرمولاسيونSH....................................................................................25جدول 3-2- تركيبهاي مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاويويتامينهايB5 براي القاء جوانه و باززايي در ارقام و گونه هاي مختلف يونجه..........................................................................................................................................................................28جدول 3-3- تركيبهاي مختلف تنظیمکنندههای رشد مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاوي ويتامينهاي B5 براي القاء كالوس در ارقام و گونههاي مختلف يونجه...............................................................................................................................................................................................29جدول 3-4- محيط كشتهاي مختلف حاوی تركيبهاي مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده براي رشد كالوس در ارقام و گونههاي مختلف يونجه ...................................................................................................................................................................................................................29جدول 3- 5- تركيبهاي مختلف تنظیمکنندههای رشدی مورد استفاده در محيط كشت پايه MS حاوي ويتامينهاي B5 براي باززايي غير مستقيم در ارقام و گونههاي مختلف يونجه.........................................................................................................................................................................29جدول 4-1- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد جوانههای القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد................................................................................................................32جدول 4-2- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula و :M.scutellata.......................................................................................................................................34جدول 4-3- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد.......................................................................................................36جدول 4-4- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula وM. scutellata....................................................................................................36جدول 4-5- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت ميانگين تعداد جوانههای القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد..................................................................................38جدول 4-6- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M. rigidula و M. scutellata...............................................................................39جدول 4-7- نتايج تجزيه واريانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO3 بر روی صفت میانگین تعدادشاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه،اردوباد.............................................................................40جدول 4-8- نتایج تجزیه واریانس تاثير محيط كشتهاي حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدونAgNO3بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M.rigidula وM.scutellata............................................................................42جدول 4-9- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در سه رقم يونجه چندساله.............................................................43جدول 4-10- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای القاء جوانه در دو گونه يونجه یکساله.............................................................44جدول 4-11- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززايي در سه رقم يونجه چند ساله...............................................................44جدول 4-12- اثر غلظتهای ترکیب مختلف BAP و NAA برای باززايي در دو گونه يونجه یکساله....................................................................45جدول 4-13- اثر غلظتهاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای القاء جوانه در سه رقم يونجه چندساله.......................................46جدول 4-14- اثر غلظتهاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای القاء جوانه و باززايي در دو گونه يونجه يكساله.........................46جدول 4-15- اثر غلظتهاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای باززايي در سه رقم يونجه چند ساله............................................47جدول 4-16- اثر غلظتهاي مختلف TDZبه همراه یا بدون AgNO3برای باززايي در دو گونه يونجه يكساله.................................................48جدول 4-17- میزان القاء كالوس در ارقام و گونههاي مختلف يونجهتحت تاثیر محیط کشتهای مختلفCIM............................................51جدول 4-18- وزن كالوسهاي رشد يافته در محيط CGM در ارقام چندساله قره يونجه و همداني..................................................................52 فهرست اشکالشكل 3-1- ضد عفوني و كشت بذور يونجه جهت تهيه ريزنمونه..................................................................................................................................27شکل 4-1- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخسارهزايي و ريشهزايي در ژنوتيپهاي چندساله يونجه......................................................................49شكل 4-2- مراحل مختلف القاء جوانه، شاخسارهزايي و ريشهزايي در دو گونه يونجه يكساله................................................................................51شكل 4-3- مراحل مختلف باززايي غيرمستقيم يونجه چندساله....................................................................................................................................53 فهرست نمودارهاعنوان صفحه نمودار 4-1- تاثير محيط كشتهاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد جوانههای القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد.....................................................................................................................................33نمودار 4-2- تاثير محيط كشتهايSIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata...........................................................................................................................................................34نمودار 4-3- تاثير محيط كشتهاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت ميانگين تعداد گياهچههاي باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد.....................................................................................................................................36نمودار 4-4- تاثير محيط كشتهاي SIM I حاوي سطوح مختلفBAP , NAA بر روی صفت میانگین تعداد گياهچههاي باززا شده در هر ريزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata................................................................................................................................37نمودار 4-5- تاثير محيط كشتهاي SIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت ميانگين تعداد جوانههای القاء شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چندساله همداني، قره يونجه، اردوباد.......................................................................................................38نمودار 4-6- تاثير محيط كشتهاي SIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت میانگین تعداد جوانههای القاء شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله M .rigidula و. M. scutellata.................................................................................................40نمودار 4-7- تاثير محيط كشتهايSIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه و بدون AgNO3 بر روی صفت ميانگين تعداد گياهچههاي باززا شده در هر ريزنمونه در 3 رقم يونجه چند ساله همداني، قره يونجه، اردوباد....................................................................................................41نمودار 4-8- تاثير محيط كشتهايSIM II حاوي سطوح مختلف TDZ همراه وبدون AgNO3بر روی صفت میانگین تعداد شاخسارههای باززا شده در هر ریزنمونه در 2 گونه يونجه یکساله...........................................................................................................................................................42نمودار 4-9- درصد ايجاد ريشه تحت تاثير تركيبات مختلف تنظیم کنندههای رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در سه رقم يونجه همداني، قره يونجه و اردوباد...............................................................................................................................................................................49نمودار 4-10- درصد ايجاد ريشه تحت تاثير تركيبات مختلف تنظیم کنندههای رشد (mg/l 5/1 , 1) NAA و (mg/l 5/1 , 1) IBA در دو گونه يونجه M. rigidula و M. scutellata........................................................................................................................................................................50 فصل اول: کلیات مقدمهيونجه(Medicago sativa L.) یکی از مهمترین گياهان علوفهاي براي تغذيه دام میباشد كه با وسعت كشت جهانی بیش از 40 میلیون هکتار، زراعت آنامروزه بسيار توسعه يافته است (زانگ و همكاران 2010). همزيستي يونجه با باكتريهاي ريزوبيوم همزيست و در نتيجه تثبيت نيتروژن، حفظ ساختار مناسب خاک و اثرات بالقوه این گیاه در مدیریت آفات به عنوان مهمترین گیاه تناوبی، اهميت آن را در كشاورزي پايدار افزايش داده است(قوامي و همكاران، 1377(. يونجه اتوتتراپلوئيد (2n = 4X = 32) و دگرگشن بوده و تنوع ژنتيكي زيادي بين ارقام مختلف آن ديده میشود. و به دلیل ظرفیت باززایی خوب درون شیشهای آن برای یک مدت زمان طولانی از اهداف مطالعات ﮊنتیکی و زیست شناسی سلولی- مولکولی بوده است(اينچوا و همكاران، 2005و شائو و همكاران، 2000). جنس Medicago ترکیبی از گونههای چندساله و یکساله میباشد. یونجههای یکساله در بیش از 250 منطقه جغرافیایی ایران پراکنده هستند که استان آذربایجان غربی یکی از نواحی رویشی آنها است (حيدري شريف آباد و همكاران، 1379). به طور كلي، اگر ژنوتيپهاي يونجه مورد بررسي قرار گيرند، امكان يافتن يك ژنوتيپ با قابليت باززايي خوب در ژرم پلاسم يونجه وجود دارد (اينچوا و همكاران،2005). افزایش کیفیت و میزان توليد و مقاومت در برابر بیماریها جزء اهداف اصلی برای اصلاح یونجه (.Medicago sativa L) میباشد، اما بیشتر دستاوردها در گذشته با استفاده از روشهای كلاسيك اصلاحي به دست آمدهاند ، نه از تکنیکهای مهندسی و اين به علت عدم وجود پروتوكل باززايي مؤفق براي طيف وسيعي از ژنوتيپ هاي يونجه میباشد (لي و همكاران،2009).اينگياه دارايسابقهتاريخي طولانی بوده و قدمتآنبهابتدايتاريختمدن ميرسد (قوامي و همكاران، 1377). احتمالا منشا آن ناحیهی كائوكاسوس (Caucasus) يعني شمال شرقي تركيه، ارمنستان و شمال غربي ايران میباشد (میکاد و همكاران، 1988). سازگاری یونجه به دامنهی وسیعی از شرایط آب و هوایی سبب شده است كه این گیاه در بيش از 40 ميليون هكتار از اراضي دنيا كشت شود (زانگ و همكاران، 2010)،كه در اين ميان آمريكا بيشترين سطح زير كشت را دارا ميباشد، بطوريكه آمريكا، اروپاي شرقي و آرژانتين به تنهايي %70 مناطق سطح زير كشت يونجه را به خود اختصاص ميدهند (ورونسي و همكاران، 2010). در ايران نيز كه از خاستگاههاي اوليه يونجه بشمار ميرود، اين گياه در 600 هزار هكتار از اراضي كشور كشت ميشود كه از اين سطح زير كشت حدود 3/4 ميليون تن علوفه خشك عاید کشاورزان میشود (آمارنامه وزارت جهاد كشاورزي، 1388). جنس Medicago به شاخة گياهان گلدار[1]، زيرشاخة نهاندانگان[2]، ردة دولپهایها[3]، راستة روزالس[4] و تيرة پاپيلوناسهآ[5] متعلق است كه شامل گونههايي است كه از لحاظ ويژگيهاي مورفولوژيكي بسيار متنوع میباشند و حدود دو سوم اين گونهها يكساله و بقيه چندساله هستند (لسينز و لسينز، 1979 و ورونسي و همكاران 2010). 1-1- تاريخچه و خصوصيات گياه شناسي يونجهيونجة زراعي (Medicago Sativa L.) كه ملكه گياهان علوفهاي نيز ناميده ميشود در بخش وسيعي از اروپا و آمريكا به عنوان مهمترين علوفة لگومي شناخته شده است. اين گياه اغلب جهت مصرف به صورت علوفة خشك، علوفة دِهيدراته، حبههاي علوفهاي، علوفة تازه، کود سبز و گهگاهي چراگاه كشت ميشود (ورونسي و همكاران2010). بقاياي يونجه مواد آلي خاك را افزايش ميدهد و سيستم ريشهاي آن مواد غذايي موجود در اعماق خاك را در بين لايههاي خاك به حركت درآورده و سبب بهبود ساختار خاك، نفوذپذيري نسبت به آب و ظرفيت نگهداري آب ميشود. كشت يونجه به مقدار كمي به علفكش و آفتكش نياز دارد و به دلیل همزيستي باكتريهاي تثبيت كنندة نيتروژن (Sinorhizobium meliloti)با ريشه آن به كود نيتروژنه نيازي ندارد، كه اين ويژگيها با ملاحظات ملي و بينالمللي فعاليتهاي كشاورزي در ارتباط با محيط زيست سازگار ميباشد. همچنين مزارع يونجه جهت غنيسازي تنوع زيستي بسيار مطلوب ميباشند (ورونسي و همكاران، 2010). اين گياه داراي پروتئين زيادي بوده و حاوي اكثر اسيدهاي آمينه، ويتامينها و هیدراتهای كربن ميباشد ومیزان فيبرعلوفه آن نيز كم ميباشد (زانگ و همكاران 2010 و مونتیرو و همکاران، 2003). جنس Medicago داراي اشكال ديپلوئيد و تتراپلوئيد M. sativa spp. Sativa،M.Sativa spp. FalcataوM. Sativa spp. Glutinosaميباشد، كه اين گونهها به آسانی به اهم تلاقي يافته و داراي كاریوتيپ مشابهي ميباشند. يکي از موانع عمده در تبادل ژن بين آنها سطح پلوئيدي است كه اين عامل ميتواند با توليد گامتهاي كاهش نيافته مرتفع گردد (مک کوی و بینگهام، 1988). اشكال ديپلوئيد و گل ارغوانی M. Sativa، M. Sativa spp. Coerulea ناميده ميشوند در حالي كه اشكال تتراپلوئيد و گل ارغواني M. Sativa، M. Sativa spp. Sativa ناميده ميشوند كه يونجههاي زراعي چندساله معمولاً در اين گروه قرار ميگيرند. در مقابل فرمهاي بالا، M. Sativa spp. Falcate داراي گلهاي زرد رنگ بوده و اشكال ديپلوئيد را شامل میشود كه داراي 4 گونه چندساله تتراپلوئيد و دو گونه چندساله هگزاپلوئيد ميباشد (ورنوسي و همكاران، 2010). در حدود 3/1 جنس Medicao را گونههای یکساله تشکیل میدهند که اکثرا دیپلوئید و خودگشن هستند و از بعضی جهات مانند رشد سریعتر، کیفیت علوفه ای و مقدار پروتئین خام نسبت گونههای چندساله برتریت نشان میدهند (زو و همكاران،1996). یونجههای یکساله (Medic) ممكن است به عنوان يك منبع مفيدبراي ژنهای دخيل در صفات زراعی مهم مانند مقاومت به تنشهاي زنده و غير زنده باشند (اينچوا و همكاران، 1999). 1-1-3- انواع یونجه زراعی داخلییونجه همدانی: در برابر سرما مقاوم بوده و ارتفاع آن بیش از سایر ارقام سردسیری و نیمه گرمسیری است. به طوری که ارتفاع ساقه به ۸۰ تا ۹۰ سانتی متر میرسد. برگهای آن کوچکتر و نازکتر و باریکتر از سایر ارقام است. این رقم در ارتفاعات زیاد به خوبی رشد میکند. دانههای آن کوچک و در حدود یک تا ۱/۲ میلی متر است. یونجه همدانی رنگ بنفش دارد و برای کشت در مناطق سرد و مرتفع مناسب است.قره یونجه: مرکز عمل آوری آن آذربایجان است. در برابر سرما مقاوم است و برای کشت به صورت یونجه یکساله و حتی دیم در مناطق سرد به خصوص آذربایجان مناسب است. 1-2- اهمیت كشت بافتكشت بافت تكنيكي است كه امكان توليد گياه در محيط درون شيشهاي را فراهم میکند. اساس اين تكنيك توتي پوتانسي است كه بيان میکند هر سلول گياهي داراي كليه اطلاعات ژنتيكي لازم براي تبديل شدن به يك گياه كامل است. بنابراين كشت سلول، بافت يا اندام اين امكان را فراهم میکند كه با كشت يكي از اجزاي فوق ساير قسمتهای گياه تشكيل شود. كشت بافت داراي اهداف متعددي است كه از جمله مهمترین آنها میتوان به موارد زير اشاره كرد:1- پي بردن به نيازهاي تغذيهاي سلول و توانايي سلول2- ريزازديادي يا تكثير سريع در فضاي محدود3- فراهم آوردن دست ورزي ژن يا مهندسي ژنتيك4- توليد گياهان هاپلوئيد5- به نژادي و تهيه نژادهاي مقاوم به شوري وخشكي6- رفع مشكلات مربوط به رويش سخت بذرها7- كشت پروتو پلاست و هيبريداسيون سوماتيكي8- كوتاه كردن مراحل چرخه زندگي گياه وتسريع گلدهي9- طولاني كردن مرحله رويشي در گياهاني كه قسمتهای رويشي آنها مصرف میشود(مانند يونجه)10- توليد گياهان عاري از ويروس11- حفظ ونگهداري ذخاير ژنتيكي12- توليد متابوليتهاي ثانويه13- گلدهي در محيط درون شیشهای14- رفع مشكلات خودناسازگارياز مشكلات كشت بافت میتوان به انواع آلودگیهای باكتريايي وقارچي اشاره كرد كه در برخي از موارد كار را با شكست مواجه میسازد. همچنين كشت بافت نياز به تجربه دارد وگياهان رشد كرده در محيط درون شيشهاي به شرايط رطوبت بالا عادت کردهاند، بنابراين بايد مرحله سازگاري را سپري كرده وسپس به خاك منتقل شوند (حسندخت و همكاران،1385). 1-3- کشت بافت گیاهیایجاد انگیزه برای بکارگیری تکنیکهای کشت بافت گیاهی در تکثیر و اصلاح گونههای گیاهی از کار اولیه مورل (1960) روی تکثیر ارکیده در محیط کشت جدید با غلظت بالایی از نمکهای معدنی توسط موراشیگ و اسکوگ (1962) ناشی شد. از آن به بعد، این تکنولوژی به صورت قابل توجهی رشد یافت وامروزه یک نقش کلیدی در تکثیر ، اصلاح و مهندسی ژنتیک گیاهی ایفا میکند.کشت بافت گیاهی بر پایه سه قابلیت گیاهی استوار است: 1 ـتوانمندی[6]که توان یا ظرفیت توارثی یک سلول گیاهی برای نمو به یک گیاه کامل با القای تحریک مناسب است. توانمندی بر این مطلب دلالت میکند که هر سلول واجد تمام اطلاعات لازم برای رشد و تکثیر میباشد. گر چه از لحاظ نظری همه سلولهای گیاهی توانمند هستند، با این حال سلولهای مریستمی بیشترین توان بیان این ویژگی را دارند. 2ـ تمایز زدایی[7]، که توان سلولهای بالغ برای بازگشت به شرایط مریستمی است و بعد از آن سلولها با بازتمایزی[8] اندامهای جدیدی را سازماندهی میکنند.3ـ شایستگی[9]، که توانایی ذاتی یک سلول یا بافت گیاهی را برای نمو در یک مسیر مشخص بیان میکند. برای مثال، سلولهای با شایستگی رویانی توانایی تبدیل شدن به رویانهای کاملاً فعال را دارند. در مقابل این اصطلاح، واژه ناشایستگی یا ناتوانی ریخت زایی بیان میشود. 1-4- تاريخچه کشت بافت يونجهباززايي گياه يونجه (.Medicago sativa L) از طريق جنينزايي از حدود 30 سال قبل گزارش شد. در آن زمان، يونجه يكي از معدود گياهان مهمي بود كه قابليت باززايي از كشت بافت را نشان داد.تحقیقات وسیعی در زمینه بهینهسازی کشت بافت یونجه انجام شده است و اکثرا باززایی غیرمستقیم از طریق جنینزایی سوماتیکی گزارش شده است(بلوچي و همكاران، 1378 و اينچوا و همكاران،2003 و 2005).باززایی غیرمستقیم بسیار زمانبر و طافتفرسا بوده و معمولا با تغییرات سوماکلونی وسیع و خصوصیات مورفولوژیکی غیرنرمال همراه است.موفقیت در کشت بافت یونجههای چندساله برای اولین بار توسط Saunders و Bingham در سال 1972 از طریق جنینزایی سوماتیکی گزارش شد (اينچوا و همكاران، c2005 ). در حال حاضر این گیاه به عنوان يك بیوراکتور سبز برای تولید متابولیتهای ثانویه و پروتئینهای نوترکیب، امکان بهبود کیفیت علوفه و سایر صفات مهم مانند مقاومت به تنشهای زیستی و غیرزیستی در حوزه زیستفناوری گیاهی از اهمیت ویژهای برخوردار است. تهیه یک روش مناسب و کارا برای باززایی کامل، سریع و تولید انبوه گیاه تحت شرایط درون شیشهای از مهمترین اهداف مطالعات کشت بافتی میباشد که میتواند در مطالعات مهندسی ژنتیک و همچنین در برنامههای اصلاحی مورد استفاده قرار گیرد. با این حال تاکنون یک روشی که برای باززایی در طیف وسیعی از ژنوتیپهای یونجه مناسب باشد، ارائه نشده است و پاسخ به کشت بافت در این جنس شدیدا وابسته به ژنوتیپ میباشد و این وضعیت، کاربرد روشهای بیوتکنولوژیکی در بهبود ژنتیکی آن را محدود میکند(مولتراسيو و همكاران، 2004 و سمك و همكاران، 2004 وكپسين و همكاران،2006). جنينزايي سوماتيكي يكی از روشهای مهم در کشت بافت به شمار میآید که در اکثرگونههاي گياهي مورد استفاده قرار میگیرد اما به دلیل مشكلات متعددي مانند سرعت رشد، تبديل آهسته و باززايي دورهاي جنينزايي سوماتيكي به گياهچههاي نرمال كاربرد رايج آنرا محدود میکنند (ايچنوا و همكاران،2005). اگرچه در بسياري از گياهان، بافت تمايز نیافته به سختی بعد از كشت تبديل به گياه میشود، اما در يونجه امكان باززايي از كالوس تشكيل شده از بافتهای متعدد حتی پروتوپلاست و سلولهای گياهي فاقد ديواره سلولي وجود دارد. اگرچه گونههاي يونجه چندساله ممكن است از طريق روشهای درون شيشهاي غيرمستقيم و يا مستقيم باززا شوند، اما اين گونهها به دليل درجه بالاي هتروزيگوسيتي و اندازه بزرگ ژنوم، نمیتوانند به عنوان مدل براي لگومها به كار روند. يونجههاي يكساله نسبت نزديكي با يونجه زراعي دارند اما آنها ديپلوئيد و خودگشن بوده و داراي سيكل زندگي كوتاه و محدود هستند؛ بنابراين از نظر تحقيقات مولكولي و ژنتيكي خيلي مناسبتر از گونههاي چندساله و دگر بارور زراعي M. sativa هستند. همچنين گونههاي وحشي ممكن است به عنوان يك مخزن مفيد براي ژنهای دخيل در صفات زراعي مثل مقاومت به تنشهاي زنده و غيرزنده باشند (ايچنوا و همكاران،1999). فصل دوم:بررسی ادبیات موضوع و سابقه تحقیق 2-1- باززايي درون شیشهای2-1-1- باززايي مستقيم در یونجهاز زمان اولين گزارشات از باززايي درون شيشهاي گياهان همه تکنیکهای درون شيشهاي عمده بر روي بافتها وسلولهاي يونجه به كار گرفته شده است.گزارشات متعددي از تراريختي ژنتيكي توسط Agrobacterium tumefaciens در يونجه وجود دارد.به هر حال در تعداد زيادي از اين روشها،يك تعداد تراريختي ايجاد شده ويا خيلي وابسته به ژنوتيپ هستند(شائو و همكاران،2000).باززايي گياه از طريق تشكيل مستقيم شاخساره ها ( شامل مجموعههايي از جوانهها ) براي دو گونه يكساله يونجه Medicago orbicularis و Medicago arabica در محيط كشت حاويTDZ mg/l 5/. و از قطعات گره ساقه و برگچه توسط اينچوا و همكاران در سال 2005 به دست آمده است. تعداد جوانههاي باززا شده در Medicago orbicularis بين 11-13 جوانه در هر ريزنمونه بود،در حاليكه درMedicago arabicaكمتر از 5-6 عدد بود.لي[12]و همكاران در سال 2009 ، باززايي مستقيم در رقم يونجه چندسالهMedicago sativa L. Eurekaرا با استفاده از ريزنمونه تهيه شده از گره كوتيلودني مورد بررسي قرار دادند و محيط كشت مورد استفاده محيط كشت MS بود. هورمونهای بکار رفته عبارت بود از:1)در مرحله1 باززايي: mg dm-3) 1-0(TDZ )mg dm-33( AgNO32) در مرحله2 باززايي:mg dm-3) 1/0-01/0 (TDZ3) الف: محيط MS بدون هورموننتايج به دست آمده نشان داد كه بيش از 3/83% شاخسارهها،ريشهدار شدند، و همه گياهچهها به محيط بيرون سازگارشده ودر خاك استقرار يافتند. اين تحقيق بر روي 8 ژنوتيپ به كار گرفته شد و محدوده فراوانيهاي باززايي از 8/63 تا 5/82 % بود. اين تحقيق نشان داد كه اگرچه شاخساره ايجاد شده از ريزنمونههاي جوانه راسي در همه محيطهاي كشت با ترکيب هورموني تيديازورون (TDZ ) با غلظتmg dm-31-0 توسعه يافتند، اما بهترين توسعه و القاء جوانه درجوانههاي راسي (7/91%) بر روي محيط كشت MS حاويmg dm-31/0TDZ به دست آمد.مهرا[13]وچيما[14]در سال 1980، تشكيل چندشاخه به وسيله فعال شدن جوانههاي جانبي نارس درپوپولوس[15] برروي محيط كشت MS حاوي BAP را گزارش كردند.روت[16]و همكاران در سال 1989 تشكيل چندشاخه را بر روي ريزنمونه گره Rosa hybrida بر روي محيط MS غني شده با BAP، GA3 و casein hydrolysate گزارش كردند.گورل[17]وگلشن[18]در سال 1998 ، تكثير شاخه از نوك شاخه Amygdalus communis بر روي محيط MS با تركيب mg/l 1/0IBA وmg/l 1BAP گزارش كردند.ايجاد چندشاخه از نوك شاخه(cm 2-1) از گياهان رشديافته در مزرعه Paederia foetida وCantella asiatica بر روي محيط MS غني شده با mg/l1BAP در 7 روز پس از كشت گزارش شده است) سينگ[19]وهمكاران، 1999).در Bixa orellana ،شارن[20]و دسااوزا[21]در سال 2000 از ريزنمونههاي جوانه راسي[22] وگره ساقه[23] بر روي محيط MS غني شده با mg/l 2-ip1(2-isopentenyl adenine ) ، گياه باززايي نمودند.افزايش mg/l) BAP3/0)و mg/l ) kinetin2/0(پاسخ خوبي به تكثير شاخه درWithania somniferaبادرصد باززايي85% داده است(كولكرني[24]وهمكاران،2000).امين[25]وهمكاران در سال 2002 گزارش كردند كه تشكيل جوانههاي جانبي بر روي قطعات گره ساقه Lxora fulgens بر روي محيط كشتMS غنی شده باmg/l) NAA 1/0mg/l) BA + (5/0(امكان پذير میباشد.محيط كشت MS حاوي تنظيم كنندههاي رشدي مثل mg/l 5/0BAP به همراه mg/l01/0NAA بهعنوان بهترين نتيجه در Utleria salcifoliaدر باززايي گياهچه گزارش شده است (گانگاپرسد[26]وهمكاران،2003). همچنين بيشترين ميزان تشكيل شاخه از مريستم درگياه Origanum vulgare توسط گلنيوسكي[27] همكاران در سال 2003 گزارش شد.در Crataeva magnaتكثير سريع بر روي محيط MS به همراه μm8/8BAP به دست آمد (بنيامين[28]وهمكاران،2004).در حاليكه در Peltophorum pterocarpum ، بالاترين تعداد شاخهها بر روي محيط كشت MS به همراهmg/l 2 kinetin و mg/l 5/0NAAمشاهده شد (اودين[29]وهمكاران ،2005).چن[30]وهمكاران در سال 2000، تشكيل شاخههاي نابجا از ريزنمونههاي ميان گره ساقهAdenophora triphylla (يك گياه دارويي مهم) را گزارش كردند. در تحقيق سرينيواسان[31] و همكاران در سال 2006،TDZ بيشترين پاسخ را در ايجاد فراواني و متوسط تعداد شاخسارههای یونجه نشان داده است. در يونجه سطحmg/l 5/0 TDZ باعث القاء بيشترين فراواني ( 92% ) همراه با متوسط تعداد 7 شاخساره بعد از 30 روز از كشت شده است.اولين بار در سال 1982 گزارش شد كه TDZداراي فعاليت سيتوكينيني میباشد. از آن زمان به بعد TDZ با موفقيت در كشت درون شيشهاي به منظور القاء تشكيل شاخسارههاي نابجا و براي افزايش تكثير جوانههاي جانبي مورد استفاده قرار گرفت. تعداد شاخسارههاي توليد شده در محيط كشت حاوي TDZ برابر و يا بيشتر از تعداد شاخههاي ايجاد شده بر روي محيط كشت حاوي سيتوكينينهاي داراي پورين میباشد. غلظتهاي پايين TDZ( mg/l088/0-0022/0) بزاي ريزازديادي موثر میباشد.يك پروتوكل باززايي با القاء تعداد زياد شاخسارههاي نابجا براي گياه بذرالبنج(Hyoscyamus niger L.) با استفاده از TDZ توسطاورنبي[32]در سال 2005 توسعه داده شد. ريزنمونههاي هيپوكتيل، كوتيلودون و ساقه بر روي محيط موراشيك و اسكوك (MS) حاوي غلظتهاي مختلف [33](BAP) و TDZ كشت شدند. محيط كشت MS حاوي µM(0.016 µL)16 TDZ در ايجاد 100% باززايي و با 1953 شاخساره در هر ريزنمونه هيپوكتيل بسيار موثر بود. گياهچهها بر روي محيط MS حاوي غلظتهاي مختلف[34]IBA و[35]NAA ريشه دار شدند. گياهچههايي با ريشه زايي و بقاء بالا با استفاده از محيط كشت MS نصف غلظت حاوي µM 8 IBA به دست آمد.ماليكارجونا[36]و همكاران در سال 2007 يك روش درون شيشهاي براي ازدياد Holarrhena antidysenterica Wall. را با استفاده از ريزنمونههاي گره از درختهاي بالغ رشد كرده در مزرعه توسعه دادند. صرفنظر از غلظتها و تركيبات تنظيم كنندههاي رشد مورد استفاده، جوانههاي جانبي و انتهايي هنگامي كه در محيط كشت موراشيك و اسكوك (MS) كشت شدند جوانه زده و رشد يافتند. بيشترين تعداد شاخسارهها در زمانيتشكيل شد كه شاخسارههاي جوانه زده از محيط پايه MS به محيط كشت MS حاوي[37] BA (mg/dm32 (وNAA ( mg/dm35/0( واكشت شدند. شاخسارههاباتعداد بيشتري از طريق واكشت بر روي محيط كشت MS حاوي BA( mg/dm35/0 (به دست آمد.با انجام واكشتهاي مكرر شاخسارههاي به دست آمده از جوانههاي جانبي گره، ميزان تكثير با فراواني زياد به دست آمد. شاخسارههاي طويل شده ، قطع شده ودر محيط پايه MS بدون اكسين ريشهدار شدند. ريشهزايي خارج شيشهاي شاخسارههاي تشكيل شده درون شيشه با غوطه ور سازي شاخسارههاي كوچك درون محلولIBA (mg/dm32 ( به مدت 2 دقيقه انجام شد. استقرار موفقيت آميز در زمين زراعي و زنده ماني زيادگياهان (80- %90) مشاهده شد. 2-1-2- باززايي غيرمستقيم در یونجهمطالعات كشت بافت مربوط به جنين زايي در يونجه در سه گروه زير دسته بندي میشود:-بهبود سيستم كشت همراه با ماتريال گياهي با قابليت باززايي زياد.-ارزيابي ماتريال گياهي براي قابليت باززايي.-و اثر متقابل مابين محيط كشت و ماتريال گياهي.به منظور استفاده از يك سيستم كشت براي اصلاح كاربردي، بهبود يك روش كشت سادهتر و يك سيستم براي ارزيابي پاسخ ژنوتيپ ها به تكثير در مقياس بزرگتر، ضروري میباشد.جنين زايي سوماتيكي يك روش اميدبخش بوده واز نظر اقتصادي براي كلون كردناكثرگونههای گياهي مهم میباشد. اگرچه اين روش براي تعداد زيادي از محصولات باارزش به كار میرود، اما هنوز وجود مشكلات متعددي، استفاده گسترده از آن را محدود میکند. سرعت پايين جوانه زني و باززايي طولاني مدت جنینهای سوماتيكي به گياهچههاي نرمال، از جمله مشكلات بحراني مهم بوده كه كاربرد تجاري آن را محدود میکند (لاي[38]وهمكاران،1995 ).يونجه از جمله محصولاتي است كه از نقطه نظر توليد جنين از طريق كشت بافت زياد مطالعه شده است) چنوهمكاران،2000(. باززايي گياهان از كشتهاي سوسپانسيوني و كالوس براي كاربرد صحيح وآسان از تنوع سوماكلونيو برنامههاي اصلاح تكاملي موجود براي اصلاح محصولات زراعي ضروري میباشد. توانايي باززايي گياهان از گونهای به گونه ديگر، از رقمي به رقم ديگر و از گياهي به گياه ديگر تغيير مییابد. همچنين باززايي تحت تاثير فاكتورهاي متعدد ديگري از جمله ماده تلقيح، سن و سلامتي گياه بخشنده، وفاكتورهاي محيطي مانند درجه حرارت وروشنايي و تركيب محيط كشت به ويژه تركيب تنظيم كننده هايرشد میباشد ) پيريك[39]، 1987).در باززايي كلي كه به وسيله ريز ازديادي میتواند صورت بگيرد، هر ارگان بافتي از طريق تكثير غيرجنسي كشت مريستمها وجنينزايي ويا ارگانزايي از سلولهای بي شكل(کشتهای سوسپانسيوني، پرتوپلاست وكالوس)، نگهداري میشود. يونجه به عنوان گونههاي مطرح شده با سيستم بذر مصنوعي بسيار پيشرفته میباشد، هر چنداستفاده از آن به منظور اهداف تكثير تجارتي هنوزدر حال ارزيابي میباشد(پيكيونيوهمكاران[40]،1997(. علاوه بر اين روشهاي مهمي با استفاده ازروشهای مهندسي ژنتيك براي بهبود ارزش تغذیهای (Schroeder et al., 1991)، افزايش تحمل به تنشهای غيرزيستي (Mckersei et al., 1993)، واستفاده از يونجه به عنوان يك منبع توليد محصولات با ارزش افزوده ايجاد شده است.مطالعات انجام شده در يونجه حاكي از آن است كه كالوسزايي و باززايي تحت تاثير عوامل ژنوتيپ،محيط كشت و ريزنمونه میباشد (Safarnejad,1996). درمطالعه ميزان باززايي در محیطهای مختلف به طور كلي وجود تنش نقش بازدارنده در عمل باززايي را ايفا میکند.Medicago orbicularis بيشترين پتانسيل را در تشكيل كالوس در همه ريزنمونهها، محیطهای كشت و شرايط آزمايشي نشان داد. محيط كشت B5 غني شده با 2.4-D 1mg/l براي كالزاييMedicago orbicularis در هر دو شرايط مطالعه شده (تاريكي و روشنايي) بهترين محيط تعيين شد.يك همبستگي مثبت مابين اندازه كوچك ژنوم Medicago orbicularis و پاسخ خوب به كشت بافت درون شيشهاي يافته شد.اولين پروتكل برای باززايي گونه يكساله M.truncatula از طريق جنينزايي سوماتيكي غير مستقيم توسط نولان[41]و همكاران در سال 1989 بهدست آمد و گزارشات كمي از آن زمان منتشر شده است. پروتكلهاي مشابهي نيز براي باززايي ديگر گونههاي يكساله از جمله درM .polymorpha،M .littoralis ،M .suffruticosaو M. lupulina ارائه شد.يك روش مؤثر براي باززايي درون شيشهايM. coerulea از طريق جنينزايي سوماتيكي غير مستقيم با استفاده از ريزنمونههاي مختلف توسط اسوتوسلاووا[42]وهمكاران در سال 2005 طراحي شد. بافت كالوسي با قابليت باززايي از منبع ريزنمونه برگ، برگچه، ساقه و ريشه، با مقدار خوب در محيط كشت MS ويا SH حاوي mg/l2/0BAPو 2,4-Dدر دو غلظتmg/l 4و2 تشكيل شد. ريزنمونه برگچه كه به عنوان ريزنمونه اوليه استفاده شد، بهترين پاسخ مورفوژنتيكي را نشان داد.در مطالعهاي توسط زارع وهمكاران در سال 2009، ارزيابي باززايي درون شيشهاي ارقام يونجه ايراني و انتخاب ژنوتيپهايي با بالاترين ظرفيت باززايي صورت گرفت. پاسخ به جنينزايي سوماتيكي در برگ و دمبرگ از 5 رقم زراعي و بومي با استفاده از 6 پروتكل باززايي مطالعه شد. نتايج تشكيل كالوس وجنينزايي وجود تفاوت مابين ودرون ارقام را نشان داد. فراواني جنينزايي و تعداد جنين در هر كالوس تحت تاثير ژنوتيپ وقطعات ريزنمونه بود. تفاوت معنيداري مابينقطعات برگ و دمبرگ از نظر جنينزايي مشاهده نشد، ولي تعداد جنينهاي ايجاد شده توسط برگ به طور معني داري بزرگتر از دمبرگ بود. در ارقام مطالعه شده، ژنوتيپهاي جنينزا در محدوده 0تا 5/18% قرار داشتند. 14 ژنوتيپ ازكل 133 ژنوتيپ جنينهاي سوماتيكي توليد كردند. سه تا از آنها بالاترين ظرفيت باززايي را نشان دادند. كارآيي تبديل جنينها به طور معنيداري تحت تاثير محيط كشت مورد استفاده براي تبديل جنين بود. به طور ميانگين، 62 % جنينهاي ژنوتيپهاي انتخابي، در محيط كشت MMS هم شاخساره و هم ريشه توليد كردند.كاﺋو[43]وهمكاران در سال 1981 كشت سوسپانسيون سلولي ريزنمونه نوك شاخساره 9گياه يونجه را انجام دادند. براساس نتايج بهدست آمده از نتايج آنها شرايط تغذيهاي متفاوت و قابل توجهي براي القاء جنينزايي در كشتهاي سلولي مشتق شده از اين گياهان ضروري بود. با تنظيم مناسب سطوح هورموني و تركيب نمكهاي معدني القاء جنين زايي در تمام 9 رقم آزمايشي امكان پذير شد. جنينهاي 7 رقم از 9 رقم زراعي توانايي تبديل به گياه را دارا بودند.القاء كالوس با قابليت جنينزايي سوماتيكي بر روي دو محيط كشت القاء كالوس، B5h و SH4K توسط تيان[44] و همكاران در سال 2002 در يونجه انجام گرفت. جنينها بر روي كالوسهاي القاء شده در محيط كشت B5h در زماني كه هنوز بر روي محيط القاء كالوس بودند تشكيل شدند، در حالي كه نتوانستند بر روي كالوسهاي القاء شده در محيط كشت SH4K تا زماني كه به محيط عاري از مواد تنظيم كننده رشد انتقال يابند، تشكيل شوند.كالوسهاي القاء شده و رشد يافته در محيط كشت B5h، قابليتجنينزايي را در طول واكشت به سرعت از دست دادند، در حالي كه كالوسهاي القاء شده و رشد يافته در محيط كشت SH4K، قابليت جنينزايي را حفظ كردند. جنينهاي القاء شده بر روي محيط كشت SH4K رشد سريعي را نشان دادند. گياهان نرمال و كاملا بارور از جنينهاي رشد يافته از كالوس بر روي محيط كشت SH4K به دست آمد.پروتكل كشت سادهای به منظور بررسي ژنوتيپهايي با قابليت باززايي توسط تاكاميزو[45]و همكاران در يك رقم سرسخت يونجه (Medicago sativa L.) در سال 1990 گسترش داده شد.26 رقم زراعي و يا نمونههاي ژرم پلاسمي به منظور بررسي قابليت آنها براي جنينزايي سوماتيكي آزمايش شدند. فراواني جنينزايي سوماتيكي 3 رقم ژاپني كاملا پايين (2%-0) بود و بنابراين به عنوان ارقام سرسخت مورد توجه قرار گرفتند. 4 محيط كشت (B2, B5h, UM, SH) به منظور بررسي قابلیتشان براي القاء جنينزايي سوماتيكي با يكديگر مقايسه شدند. جنينزايي سوماتيكي تنها در محيط كشت UM اتفاق افتاد. داكيو[46] و همكاران در سال 2006، توانستند شرايط باززايي گياهان را از طريق جنينزايي سوماتيكي از كشتهاي سوسپانسيون سلولي از M. truncatula رقم Jemalong لاين M9-10a برقرار كنند.اينچوا[47] و همكاران نيز در سال 2001و 2005، كشتهاي سوسپانسيون سلولي را با استفاده از ريزنمونههاي برگ و ريشه M. truncatula- R108-1و M. truncatula-Jemalong (حاصل از جمع آوري بذور) انجامدادند.ژنوتيپ فاكتور خيلي مهم در توانايي پاسخ به جنينزايي میباشد. تغيير پذيري در القاء و فراواني جنینهای حاصل، در ميان گونههاي مختلفي از جنس Medicago و درون ارقام مشاهده شده است )چنوهمكاران،;1987 براون[48]وهمكاران،(1985. تفاوتهاي قابل توجهي نيز در قابليت جنينزايي مابين جمعيتهاي يك رقم يا گونه مشاهده شده است.قابليت جنينزايي وابسته به ژنوتيپ به طور وسيع به ويژه در M. sativa توسط كريس[49]و همكاران(1988)، ميتن[50]و همكاران(1984)، چن و همكاران (1987)، نگرادجان[51]و همكاران(1986)، باربولوا[52]و همكاران(2002) واينچواو همكاران (1994) گزارش شده است. پاسخ مناسب يونجههاي يكسالهبا اندازه ژنومي كوچك نسبت به محيط كشت درون شیشهای چه در القاء كالوس و جنين زايي و چه در باززايي مستقيم گزارش شده است. انتخاب ريزنمونه فاكتور مهمي است كه موفقيت در ايجاد پروتوكل جنينزايي را تعيين ميكند. علاوه بر اين، باززايي جنين سوماتيكي از منشاء مختلف ريزنمونه در گونههاي چندساله و يكساله Medicago حاصل شده است. جنينزايي سوماتيكي غيرمستقيم در M.sativa از ريزنمونههاي زيادي مانند برگ(Meijer et al. 1987; Barbulova et al. 2002) ، برگچه et al.1994),(Lai، ميان گره(Parrott et al. 1993), ، جنين نارسNinkovic et al. 1995),، هيپوكتي?