چکيده:زمينه و هدف: هليکوباکتر پيلوري اولين باکتري سرطان زاي قطعي است که شناخته شده است. عفونت با اين باکتري از شايع ترين عفونت هاي انساني است که بيش از نيمي از جمعيت جهان را در بر مي گيرد و طيفي از بيماري هاي گاسترودئودنال را ايجاد مي كند. اين بيماري ها شامل التهاب مزمن معده بدون علائم کلينيکي، زخم هاي معده و دوازدهه، سرطان معده (آدنوکارسينوما) و لنفوماي بافت هاي لنفاوي مرتبط با مخاط (MALT) مي باشد. باتوجه به شيوع بالاي هليکوباکتر پيلوري و بيماري متعاقب آن در جوامع بشري، کشف و توسعه تکنيک هاي نوين و غير تهاجمي براي تشخيص اين باکتري ضرورت دارد. هدف از اين پژوهش شناسايي هليکوباکتر پيلوري در نمونه مدفوع بيماران مبتلا به بيماري هاي گاسترودئودنال با استفاده از روشloop mediated isothermal amplification (LAMP) و مقايسه ي آن به روشPCR است.مواد و روش ها: اين پژوهش به صورت توصيفي تحليلي است که به روش مقطعي ( cross sectional) بر روي100 بيمار مراجعه کننده به بخش آندوسکوپي بيمارستان امام خميني در سال 1390 انجام پذيرفت. از هر بيمار دونمونه بيوپسي از ناحيه آنتروم و دو نمونه بيوپسي از ناحيه كورپوس معده و نيز نمونه مدفوع گرفته شد. دو نمونه بيوپسي براي آزمايش اوره آز سريع استفاده شد و دوتاي ديگر در محيط ترانسپورت جمع آوري و به آزمايشگاه ميکروبيولوژي دانشکده پزشکي منتقل شد. نمونه هاي مدفوع همچنين تا زمان استخراج DNA در دماي 70- نگه داري شدند. نمونه هاي بيوپسي بر روي محيط کلمبيا آگار تخم مرغ دار حاوي آنتي بيوتيک هاي وانکومايسين (6mg/L)، تري متوپريم (5mg/L) و آمفوتريسين بي (2mg/L) کشت داده شد و در شرايط ميکروائروفيل گرمخانه گذاري گرديد. براي تعيين هويت هليکوباکتر پيلوري از روش رنگ آميزي گرم، اوره آز، کاتالاز، اکسيداز استفاده گرديد. DNA نمونه هاي مدفوع پس از يک گرما گذاري توسط کيت اختصاصي استخراج DNA از مدفوع (QIA amp DNA Stool Mini kit, Qiagene, Germany) بر طبق دستورالعمل کيت استخراج شد.استاندارد طلايي در اين مطالعه تست اوره آز مايع و کشت در نظر گرفته شده است. براساس نتايج استاندارد طلايي حساسيت و اختصاصيت دو تست PCR و LAMP مقايسه شد. حساسيت، ويژگي،ارزش اخباري مثبت و ارزش اخباري منفي.با استفاده از نرم افزار آماري STATAمحاسبه شد.يافته ها: از 100 نمونه بيوپسي بررسی شده، 53 نمونه بر اساس تست اوره آز سريع و 44 نمونه براساس کشت مثبت شد. از نمونه هاي مدفوع بررسي شده توسط PCR وLAMP اختصاصي ژن ureC به ترتيب 68 نمونه(68%) و 82 نمونه (82%) مثبت شدند.حساسيت، ويژگي، ارزش اخباري مثبت و ارزش اخباري منفي روش PCR نسبت به استاندارد طلايي يعني کشت و آزمون اوره آز سريع به ترتيب 100%، 2/76% ، 85% و 100% محاسبه شد. Concordance بين PCR و Gold-standard داراي ضريب κ برابر 7878/0 وتوافق90%مي باشد. اين ميزان ضريب كاپا (7878/0) به معني Substantial agreement يا توافق قابل توجه و معتبر مي باشد.همچنين حساسيت، ويژگي،ارزش اخباري مثبت و ارزش اخباري منفي روش LAMP به ترتيب 100% ، 8/42% ، 7/70% و 100% محاسبه شد. Concordance بين LAMP و استاندارد طلایی داراي ضريب کاپا برابر 4652/0 و توافق 76% مي باشد. اين ميزان ضريب کاپا به معني Moderate agreement يا توافق ميانه مي باشد. حداقل غلظت تشخيص روش هاي PCR و LAMP ، ده فمتوگرم بود.نتيجه گيري: تشخيص هليکوباکتر پيلوري با استفاده از روش LAMP ده بار حساس تر از روش PCR بود. اين روش ها با حساحسيت و اختصاصيت بالا مي توانند در تشخيص سريع و غير تهاجمي هليکوباکتر پيلوري در نمونه هاي مدفوع کاربرد داشته باشند. البته بايد ذکر کرد که روش LAMP سريعتر، راحتتر و بدون نياز به ترموسايکلر است.واژگان کليدي: هليکوباکتر پيلوري،تشخيص مولكولي ،PCR، LAMP. مقدمه:هليکوباکتر پيلوري باسيل گرم منفي خميده ميکروا ئروفيل مي باشد (et al,2009 Atherton, J. C,). هليکوباکتر پيلوري عامل گاستريت، زخم معده و دوازدهه ، سرطان معده، لنفوماي غشاي مخاطي و آدنوکارسينوماي معدهاست( ,et al, 2008 Fock, K. M). هليکوباکتر پيلوري موجب القاي گاستريت ميشود که بيماري التهاب مخاط معده همراه با ادم، پرخوني و ارتشاح نوتروفيل ها است(Matysiak-Budnika. T,2006 و, et al, 2008 Daugule. I ). زخم پپتيک نيز به صورت از هم گسيختگي مخاط معده و يا دئودنوم تعريف ميشود که به دليل التهاب فعال منجر به نقص موضعي يا ايجاد حفره مي گردد(Begum. S,et al,2000 ).سرطان معده بيشتر به دنبال عفونت هاي معده توسط هليکوباکتر پيلوري و درمان ناکافي عفونت به وجود مي آيد چهارمين سرطان رايج و دومين عامل ايجاد سرطان هاي مرتبط با مرگ در دنياست,1998)Nachmkin. I و, et al,1991 Czinn S.J). برطبق برخي تخمين ها بيش از 930000 مورد جديد از سرطان معده هرساله تشخيص داده ميشودو حدود 700000 از اين مبتلايان خواهند مرد (, et al ,2002 Richard .M ). اين سرطان در قسمت آنتروم معده ايجاد مي شود . در سال 1994 سازمان بين المللي تحقيقات سرطان (IARC) هليکوباکتر پيلوري را جزء کلاس يک کارسينوژن ها معرفي کرد(Matysiak-Budnika. T,et al,2006).براساس بيانيه ماستريخت (به روز رساني چهارم) براي تشخيص هليکوباکتر پيلوري استراتژي تست ودرمان براي سوء هاضمه هاي بررسي نشده در جمعيت هايي که شيوع هليکوباکتر پيلوري تقريبا بالاي 20 درصد است، درخور ومناسب است.اين استراتژي به لحاظ هزينه سودمند وبه صرفه ميباشد وبراي بيماران با علائم هشدار دهنده ويا بيماران با سن بالا قابل کاربرد نمي باشد(Johannes G. Kusters,et al ,2006).تست هاي تهاجمی که در اين استراتژي ميتواند استفاده شود هيستوپاتولوژي،کشت، تست اوره آز سريع (RUT) روي نمونه هاي بيوپسي معده، و از تست های غیرتهاجمی تست تنفسي اوره(UBT)، روش هاي مولکولي و آناليز سرولوژيکي براي تشخيص هليکوباکتر پيلوري معرفي شده است (Johannes G. Kusters,et al ,2006 و Traci L. Testerman, et al, 2001).کشت هليکوباکترپيلوري يک کشت مشکل وزمان بر است بخصوص کشت اين باکتري از مدفوع به دليل رشد بيش از حد باکتري هاي ديگر فوق العاده مشکل است(2001Andersen L. P, وHiroaki Takeuchi,et al, 2001).تست تنفسي اوره يک تست غيرتهاجمي است که CO2 توليد شده توسط اوره از هليکوباکترپيلوري را اشکارسازي ميکند،اما اين تست يک تست گران قيمت محسوب ميشود (Hiroaki Takeuchi,et al, 2001).PCR روشي سريع وحساس است وبه علت کارايي بالا بطور گسترده اي در تشخيص سريع پاتوژن ها بکار گرفته ميشوداما داراي محدوديت هايي مي باشد از جمله پيچيده بودن تکنيک، استفاده از دستگاه هاي مربوط به زمان ،استفاده از جرخه گرمايي وهزينه هاي بالاتري که ميطلبدو همچنين به دليل وجود مهارکننده هايي که در مدفوع وجود دارد استفاده از اين تکنيک را با مشکل مواجه ميکند.به همين دليل جهت رفع اين مشکلات روشloop mediated isothermal amplification(LAM) که يکي ديگر از روش هاي غيرتهاجمي جهت تشخيص باکتري محسوب ميشود، بکار گرفته شد که معايب روش هاي مبتني بر PCRرا به حداقل برساند (, 2005Crowe S. E و Mini R , et al, 2006).در اين روش با استفاده از آنزيمBst DNA polymerase،قطعه بزرگي از DNA با جا به جا شدن آنزيم روي هر دو رشتهDNAبه صورت Autocycling سنتز مي شود.دراين روش از يک دماي واکنش پائين و isothermal (C°65-60) به مدت 60 دقيقه استفاده مي شود(, et al, 2006 Karima TM, 2006 , Grebowska. A ) . کدورت واکنش متناسب با مقدار سنتز DNAافزايش مي يابد و در نتيجه از ايجاد رسوب سفيد رنگ به عنوان شاخصي براي شناسايي اسيدهاي نوکلئيک تکثير يافته استفاده مي شود (Williams CL,1997و Exner .MM, et al,1995 ).برخي از ويژگي هاي روشLAMP عبارتند از:سادگي ، سرعت ،حساسيت واختصاصيت بالاتر.در اين روش نيازي به دستگاه ترموسايکلر نداريم وDNAهدف در يک شرايط ايزوترم(هم دما) تکثير ميشود. هم چنين از آن جايي كه در تکثير به روش LAMP مقدار زيادي محصول توليد مي شودديگر براي تشخيص پاياني نياز به ژل الکتروفورز نيست و مي توانبا چشم غير مسلح شناسايي کرد(Ching CK, et al, 1996).اين تکنيک نياز به واسرشت سازي( denaturation) اسيد نوکلئيک دورشته اي به تک رشته اي براي شروع پليمريزاسيون نداردهمچنين روش LAMP نياز به مواد شيميايي ويژه ويا دستگاه هاي گران قيمت ازمايشگاهي ندارد(Crowe S. E, 2005).با وجود مزاياي ذکرشده براي اين تکنيک نوين در تشخيص ساده وسريع ميکروارگانيسم ها ودر اين مطالعه باتوجه به شيوع بالاي هليکوباکتر پيلوري وبيماري متعاقب ان در جوامع بشري کشف وتوسعه تکنيک هاي نوين براي تشخيص اين باکتري ضرورت داردودر اينجا تکنيک LAMP باکتري را سريع تشخيص داده تا با اغاز درمان مناسب از پيشرفت عفونت به سمت عفونت هاي مرتبط با هليکوباکتر پيلوري تا حدي جلوگيري شود.علاوه بر کارايي اين تکنيک در شناسايي دقيق وسريع هليکوباکتر پيلوري ميتواند در مطالعات اپيدميولوژيک وبررسي شيوع واپيدمي اين باکتري در جوامع مختلف استفاده شود. هدف از انجام اين مطالعه تعيين ارزش تشخيصي تكثير هم دماي وابسته به لوپ براي شناسايي هليکوباکتر پيلوري در مدفوع بيماران مبتلا به بيماري هاي گاسترودئودنالميباشد.کلياتآشنايي با هليكوباكترپيلوري1-3 معرفي باکتري هليکوباکتر پيلوري:هليکوباکترپيلوري اولين باکتري سرطان زايي است که شناخته شده است. عفونت با اين باکتري از شايع ترين عفونت هاي انساني است که بيش از نيمي از جمعيت جهان را در بر مي گيرد (Atherton, J. C, et al, et al,2009). در کشورهاي توسعه يافته حدود 50 درصد از افراد بزرگسال با اين باکتري آلوده هستند، در حالي که در کشورهاي در حال توسعه اين رقم تا 90 درصد هم گزارش شده است (Fock, K. M, et al, 2008). عفونت هليکوباکتر پيلوري يک فاکتور کليدي در بيماري هاي روده اي- معده اي است که يک طيف از بيماري ها از التهاب مزمن معده بدون علائم کلينيکي تا زخم هاي معده و روده و سرطان معده (آدنوکارسينوما) و لنفوماي مخاط مرتبط با بافت هاي لنفاوي (MALT) را شامل ميشود (Matysiak-Budnika. T, et al, 2006). هليکوباکتر پيلوري به عنوان عامل اصلي گاستريت مزمن و زخم هاي پپتيک در کودکان و بزرگسالان شناخته شده است. علاوه بر اين باکتري ميتواند خطر بدخيمي در بزرگسالان را افزايش دهد(,et al, 2008Daugule. I). به طور کلي براي ريشه کني هليکوباکترپيلوري از يک درمان تركيبي متشكل از ممانعت کننده پمپ پروتون، بيسموت و آنتي بيوتيک هايي مانند مترونيدازول، آموکسي سيلين، تتراسايکلين يا کلاريترومايسين استفاده ميشود (Atherton, J. C, et al, et al,2009 و Begum. S, 2000). مقاومت هليکوباکتر پيلوري به عوامل ضد ميکروبي در جهان در حال گسترش است و بسته به ناحيه جغرافيايي شيوع آن متفاوت است (Czinn S.J, et al, 1991).1-2 تاريخچه:در قرن بيستم، چندين محقق وجود ميکروارگانيسم هاي مارپيچي شکل را درون معده جانوران گزارش کردند. Bizzozero در سال 1893 وجود ارگانيسم هاي مارپيچي کلونيزه شده در مخاط و غدد معده سگ هاي سالم را براي اولين بار گزارش شده است (,et al, 1998Nachmkin. I). Salomon در سال 1896 وجود اين ارگانيسم ها را تاييد کرده و همينطور نشان دادکه آنها درگربه ها و رات ها هم وجود دارند اما در انسان ديده نمي شوند. نخستين بار Keriemtz در سال 1906 ارگانيسمهاي مارپيچي شکل را در معده انسان مشاهده وگزارش داد (, et al, 2002Richard. M). او سه نوع مختلف از اسپيروکت ها را در بيماري که مبتلا به کارسينوماي انحناي کوچک معده بود توضيح داد. احتمالاً يکي از آنها هليکوباکتر پيلوري بوده است ( Nachmkin.I, et al, 1998). در سال 1940 Freedberg و Baron ارگانيسم هاي مشابهي را در 37% نمونه هاي گرفته شده از معده بيماران مبتلا به زخم معده و کارسينوما مشاهده کردند (Johannes G. Kusters , et al ,2006). حدود 20 سال پيش Barry Marshall و Robin Warren به طور موفقيت آميزي هليکوباکتر پيلوري را کشت دادند. آزمايشات انجام شده توسط Marshall و Morris و آزمايشات بعدي بعضي از اصول کخ را در مورد بيماري زايي اين باکتري اثبات کرد. اين آزمايشات نشان داد که اين باکتري ميتواند در معده انسان کلونيزه شده و باعث ايجاد التهاب مخاط معده شوند اما مدل حيواني مناسبي به منظور اثبات بيماريزا بودن آن وجود نداشت (Johannes G. Kusters , et al ,2006). ابتدا ارگانيسم شناخته شده در معده Campylobacter- like organism ناميده شد سپس اين نام به Campylobacter-like Gastric تغيير يافت و بعد از آن Campylobacter pyloridis ونهايتا Campylobacter pylori ناميده شد. امروزه اين باکتري با نام Helicpobacter pylori شناخته ميشود (Johannes G. Kusters , et al ,2006 و Nachmkin.I, et al, 1998 ). مدت کمي بعد مشخص شد که اين باکتري عامل التهاب مزمن معده است که در طولاني مدت با پيشرفت همراه است و ميتواند منجر به زخم معده، آدنوکارسينوماي معده و لنفوماي معده شود (8). 1-3 طبقه بندي:هليکوباکتر متعلق به زير شاخه proteabacteria، راسته Campylobacter و خانواده Helicobacteraceae است. اين خانواده همچنين شامل جنس هاي Wolinella، Flexispira، Sulfurimonas و Thiovulum ميباشد (Johannes G. Kusters , et al ,2006). تا به امروز جنس هليکوباکتر شامل بيش از 20 گونه شناخته شده است. همه گونه هاي هليکوباکتر ميکروآئروفيل بوده و در بيشتر موارد کاتالاز و اکسيداز مثبت هستند و همچنين اوره آز مثبت هستند (Johannes G. Kusters , et al ,2006 و Nachmkin.I, et al, 1998). صفاتي که باعث تمايز اين باکتري ازکمپيلوباکتر ها مي شود عبارتند از:1-داشتن تاژک هاي پوششدار 2- توانايي زياد براي هيدروليز اوره 3- الگوي ويژه اسيدهاي چرب (درصد بالايي از اسيدهاي 14کربنه و درصد کمي از اسيدهاي 16 کربنه و وجود اسيد آمينه 18 کربنه) (Begum S, et al, 2000). در زمينه طبقه بندي باکتري مشخص شده است که اين باکتري گرم منفي، خارج سلولي، داراي فلاژل ومتحرک مي باشد(Johannes G. Kusters , et al ,2006).گونه هاي هليکوباکتر ميتوانند به دو سويه اصلي و عمده تقسيم شوند:1- گونه هاي هليکوباکتر معده اي2- گونه هاي هليکوباکتر داخل کبديهر دو گروه داراي جايگاه اختصاصي هستند مثلا هليکوباکترهاي معده اي قادر به کلونيزاسيون در داخل روده و کبد نيستند و برعکس (Johannes G. Kusters , et al ,2006).1-3-1 گونه هاي هليکوباکتر معده اي:گونه هاي هليکوباکتر معده اي گونه هايي هستند که به شرايط معده و مخاط موکوسي آن سازگار شده اند و در معده اغلب پستانداران ميتوانند کلونيزه شوند و همگي اعضاي خانواده هليکوباکتر هستند.مهمترين و شايع ترين گونه هاي معده اي عبارتند از: 1- Helicobacter pyloriFelis 2-Helicobacter3- Helicobacter mustelae4- Helicobacter acinonychis5-Helicobacter heilmanniiهليکوباکتر پيلوري در انسان وجود دارد، H. felis مارپيچي شکل بوده واولين بار از معده گربه وسپس سگ جداشد.H. mustelae مدت کوتاهي پس از H. pylori کشف شد. از معده راسو ايزوله شد.H. acinonychis شبيه ترين باکتري به H. pylori است و از معده گربه سانان بزرگ جدا شده است. اماH. heilmannii طيف ميزبان وسيعي دارد(Johannes G. Kusters , et al ,2006و Nachmkin.I, et al, 1998 ).