پايان نامه جهت دريافت درجه دكتراي تخصصي كلينيكال پاتولوژي موضوع بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيدس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله‌ها و بزهاي كشتارشده به روش PCRفهرست عنوان صفحه الف- مقدمه 1 ب-چکيده 3 فصل اول:کليات 5 1- تاريخچه 6 2- خصوصيات کلي مايکوپلاسما 6 3- مقاومت مايکوپلاسماها 8 4- طبقه بندي مايکوپلاسماها 9 5- طبقه بندي کلاستر مايکوئيدس 12 6- فيلوژني 14 7- ساختمان 15 1-7-ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس 15 2-7- ساختمان مايکوپلاسما کاپري کولوم 17 8- بيولوژي مولکولي 19 9- توالي‌هاي تکراري 23 10- پروتئينهاي سطحي 25 11- فاکتور حدت 30 12- آناليز پروتئين 32 13- طبقه بندي سويه‌ها 34 14- مشخصات گونه مايکوئيدس 35 15- کشت و رشد گونه مايکوئيدس 38 16- کشت و رشد گونه کاپري کولوم 41 1-16- محيط Thiacourt 41 17- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان 44 1-17- علائم باليني 45 2-17- علائم کالبدگشايي بيماري 47 3-17- پاتوژنز 50 1-3-17- مکانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني 53 4-17- اختصاصيت ميزبان 57 5-17- انتقال بيماري 58 6-17- سير همه گيري 59 فهرست عنوان صفحه 1-6-17- مخزن 59 2-6-17- راه انتقال 59 7-17- پيشگيري و کنترل 60 1-7-17- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري 61 2-7-17- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 62 3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 63 18- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان 63 1-18- علائم باليني 64 2-18- علائم کالبد گشايي 66 19- گونه مايکوپلاسما کاپريکولوم کاپريکولوم 69 1-19- سندروم MASKePs 70 2-19- علائم باليني 71 3-19- علائم کالبد گشايي 71 4-19- سندروم آگالاکتيه واگير 73 20- گونه مايکوپلاسما کاپري 73 1-20- بيماريزايي 73 2-20- علائم کالبد گشايي 74 21- سير همه‌گيري 75 1-21-مخزن 75 2-21-راه انتقال 76 3-21-جمعيت ميزبان 77 22-پيشگيري وکنترل 77 1-22- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري 77 2-22- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 78 3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 78 23-واکسن 79 1-23-واکسن MmmLC 79 2-23-واکسن Mccp 79 3-23-واکسن Mcc 79 79-اختصاصيت ميزبان در کلاستر مايکوئيدس .................. 80 فهرست عنوان صفحه 25-تشخيص افتراقي 80 1-25-شناسايي عامل بيماري زا 81 1-1-25-بررسي ميکروسکوپيک اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي 81 2-25- تشخيص آزمايشگاهي 81 1-2-25- روش کشت و جداسازي 81 1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82 2-1-2-25- آماده سازي نمونه ها 82 3-25- تستهاي بيوشيمي 83 4-25- روشهاي سرولوژي 85 1-4-25- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي 85 2-4-25- تست مهاري رشد 87 3-4-25- تست ايمونو فلورسانس 88 4-4-25- تست رسوب ژلي 88 5-4-25- تست فيکساسيون کامپلمان 89 6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون 89 7-4-25- تست آگلوتيناسيون لاتکس 90 8-4-25- تست اليزاي رقابتي 91 9-4-25- ساير تستهاي تشخيصي 94 5-25 - مشکلات روشهاي سنتي 94 6-25- تشخيص با استفاده از PCR 95 فصل دوم: روش کار 26- روش کار 101 1-26- جمع آوري نمونه 101 1-1-26- مواد لازم 101 2-1-26- بخش جمع آوري نمونه 101 3-1-26- نمونه برداري 103 2-26- کشت و جداسازي نمونه ها 104 1-2-26- مواد لازم 104 فهرست عنوان صفحه 2-2-26- طرز تهيه محيط کشت اختصاصي براي جداسازي مايکوپلاسماي نشخوار کنندگان 106 1-2-2-26- مواد لازم 106 2-2-2-26- روش تهيه محيط کشت 107 3-26- استخراج DNA مايکوپلاسما 109 1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي 109 4-26- فرايند PCR 110 1-4-26- مواد لازم 110 2-4-26- آماده سازي مواد جهت واکنش PCR 112 1-2-4-26- افزوده سازي DNA نمونه‌ها 112 2-2-4-26- افزوده سازي DNA کلونيهاي جدا شده 115 3-2-4-26- تهيه مخلوط اصلي اوليه 115 3-4-26- پرايمرها 115 4-26- واکنش PCR 117 5-26- تهيه ژل الکتروفورز 118 1-5-26- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد 119 6-26- الکتروفورز 121 7-26- رويت باندهاي ايجاد شده 122 فصل سوم: نتايج 27- نتايج 124 1-27- جداسازي 124 1-1-27- بررسي عملکرد محيط کشت 124 2-1-27- نتايج کشت نمونه هاي ارسالي 124 1-2-1-27- نتايج روز پنجم 125 2-2-1-27- نتايج روزهفتم تا دهم 125 3-2-1-27- نتايج روزپانزدهم 126 2-27- نتايج PCR 126 1-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر جنس 126 2-2-27- تائيد کلوني هاي جدا شده 127 3-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر کلاستر مايکوئيدس 127 4-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاکتيه 128 5-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايکوئيدس کلوني بزرگ 129 3-27- نتايج کالبد گشايي 130 1-3-27- معيار انتخاب 130 فهرست عنوان صفحه فصل چهارم: بررسي نتايج نمودارها 131 فصل پنجم: بحث 28- بحث 139 1-28- ضايعات کالبد گشايي 139 2-28- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايکوپلاسما 141 3-28- روش کشت 142 4-28- روش PCR 147 5-28- فراواني گونه ها 152 29- خلاصه انگليسي 159 30- منابع 160 فهرست تصاوير عنوان صفحه تصوير شماره 1: کلوني تخم مرغي شکل مايکوپلاسما پس از سومين ساب کالچر 125 تصوير شماره 2: آزمايش PCR براي تشخيص جنس مايکوپلاسما در نمونه ريه 127 تصوير شماره 3: آزمايش PCR براي تشخيص کلاستر مايکوئيدس در نمونه ريه 128 تصوير شماره 4: آزمايش PCR براي تشخيص گونه آگالاکتيه درنمونه ريه 129 تصوير شماره 5: آزمايش PCR براي تشخيص گونه مايکوئيدس مايکوئيدس کلوني بزرگ 130 فهرست جداول عنوان صفحه جدول1: طبقه بندي مايکوپلاسما 11 جدول 2: معرفي اعضا کلاستر مايکوئيدس و خصوصيات بيماريزايي آنها 11 جدول 3: احتياجات غذايي براي رشد مايکوپلاسماهاي کلاستر مايکوئيدس 39 جدول 4 : مقادير موردنياز جهت تهيه مخلوط اصلي اوليه 112 جدول 5: مواد مورد نياز واکنش تکثير 114 جدول6 : پرايمرهاي استفاده شده در واکنش تکثير 116 جدول 7 : برنامه واکنش پرايمرها 118 جدول8: : فرمول تهيه محيط TBE(5X) 120 جدول9: ميزان اتيديوم برومايد مصرفي جهت ساختن مقادير متفاوت ژل 120 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار شماره 1: درصد مايکوپلاسماي جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه 132 نمودارشماره 2: درصد حضور مايکوپلاسما درعفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه به روشPCR 132 نمودار شماره3 : مقايسه روشهاي کشت و PCR در تشخيص مايکوپلاسما ي موجود در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه 133 نمودار شماره4: مقايسه نتايج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 133 نمودار شماره 5: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گاو (n=50) 134 نمودار شماره 6: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گله هاي گوسفند (n=30) 134 نمودار شماره 7: مقايسه نتايج کشت و PCR در گله‌هاي بز (n=20) 135 نمودار شماره8: نمودار شماره 8:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 135 نمودار شماره 9: نمودار شماره9:مقايسه نتايج ايجاد کدورت در محيط براث و جداسازي مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 136 نمودار شماره 10: نمودار شماره10: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گاو(n=50) 136 نمودار شماره 11: نمودار شماره 11:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي بز (n=20) 137 نمودار شماره12: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گوسفند (n=30) 137
پايان نامه جهت دريافت درجه دكتراي تخصصي كلينيكال پاتولوژي موضوع بررسي عفونت ريوي مايكوپلاسمايي ناشي از مايكوپلاسما مايكوئيدس واريته مايكوئيدس و مايكوپلاسما كاپري كولوم واريته كاپري كولوم در گوساله‌ها و بزهاي كشتارشده به روش PCRفهرست عنوان صفحه الف- مقدمه 1 ب-چکيده 3 فصل اول:کليات 5 1- تاريخچه 6 2- خصوصيات کلي مايکوپلاسما 6 3- مقاومت مايکوپلاسماها 8 4- طبقه بندي مايکوپلاسماها 9 5- طبقه بندي کلاستر مايکوئيدس 12 6- فيلوژني 14 7- ساختمان 15 1-7-ساختمان مايکوپلاسما مايکوئيدس 15 2-7- ساختمان مايکوپلاسما کاپري کولوم 17 8- بيولوژي مولکولي 19 9- توالي‌هاي تکراري 23 10- پروتئينهاي سطحي 25 11- فاکتور حدت 30 12- آناليز پروتئين 32 13- طبقه بندي سويه‌ها 34 14- مشخصات گونه مايکوئيدس 35 15- کشت و رشد گونه مايکوئيدس 38 16- کشت و رشد گونه کاپري کولوم 41 1-16- محيط Thiacourt 41 17- بيماري پلوروپنوموني واگير گاوان 44 1-17- علائم باليني 45 2-17- علائم کالبدگشايي بيماري 47 3-17- پاتوژنز 50 1-3-17- مکانيسمهاي مقابله با دستگاه ايمني 53 4-17- اختصاصيت ميزبان 57 5-17- انتقال بيماري 58 6-17- سير همه گيري 59 فهرست عنوان صفحه 1-6-17- مخزن 59 2-6-17- راه انتقال 59 7-17- پيشگيري و کنترل 60 1-7-17- اقدامات لازم براي حفاظت مناطق عاري از بيماري 61 2-7-17- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 62 3-7-17- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 63 18- بيماري پلوروپنوموني واگير بزان 63 1-18- علائم باليني 64 2-18- علائم کالبد گشايي 66 19- گونه مايکوپلاسما کاپريکولوم کاپريکولوم 69 1-19- سندروم MASKePs 70 2-19- علائم باليني 71 3-19- علائم کالبد گشايي 71 4-19- سندروم آگالاکتيه واگير 73 20- گونه مايکوپلاسما کاپري 73 1-20- بيماريزايي 73 2-20- علائم کالبد گشايي 74 21- سير همه‌گيري 75 1-21-مخزن 75 2-21-راه انتقال 76 3-21-جمعيت ميزبان 77 22-پيشگيري وکنترل 77 1-22- اقدامات لازم براي محافظت مناطق عاري از بيماري 77 2-22- اقدامات لازم هنگام شيوع بيماري 78 3-22- اقدامات لازم در مناطق آلوده بومي 78 23-واکسن 79 1-23-واکسن MmmLC 79 2-23-واکسن Mccp 79 3-23-واکسن Mcc 79 79-اختصاصيت ميزبان در کلاستر مايکوئيدس .................. 80 فهرست عنوان صفحه 25-تشخيص افتراقي 80 1-25-شناسايي عامل بيماري زا 81 1-1-25-بررسي ميکروسکوپيک اگزوداي ريه از طريق تهيه اسمير يا برش بافتي 81 2-25- تشخيص آزمايشگاهي 81 1-2-25- روش کشت و جداسازي 81 1-1-2-25- انتخاب نمونه ها 82 2-1-2-25- آماده سازي نمونه ها 82 3-25- تستهاي بيوشيمي 83 4-25- روشهاي سرولوژي 85 1-4-25- عوامل موثر در آزمايشات سرولوژي 85 2-4-25- تست مهاري رشد 87 3-4-25- تست ايمونو فلورسانس 88 4-4-25- تست رسوب ژلي 88 5-4-25- تست فيکساسيون کامپلمان 89 6-4-25- تست ممانعت از هماگلوتيناسيون 89 7-4-25- تست آگلوتيناسيون لاتکس 90 8-4-25- تست اليزاي رقابتي 91 9-4-25- ساير تستهاي تشخيصي 94 5-25 - مشکلات روشهاي سنتي 94 6-25- تشخيص با استفاده از PCR 95 فصل دوم: روش کار 26- روش کار 101 1-26- جمع آوري نمونه 101 1-1-26- مواد لازم 101 2-1-26- بخش جمع آوري نمونه 101 3-1-26- نمونه برداري 103 2-26- کشت و جداسازي نمونه ها 104 1-2-26- مواد لازم 104 فهرست عنوان صفحه 2-2-26- طرز تهيه محيط کشت اختصاصي براي جداسازي مايکوپلاسماي نشخوار کنندگان 106 1-2-2-26- مواد لازم 106 2-2-2-26- روش تهيه محيط کشت 107 3-26- استخراج DNA مايکوپلاسما 109 1-3-26- روش استخراج DNA از نمونه هاي ارسالي 109 4-26- فرايند PCR 110 1-4-26- مواد لازم 110 2-4-26- آماده سازي مواد جهت واکنش PCR 112 1-2-4-26- افزوده سازي DNA نمونه‌ها 112 2-2-4-26- افزوده سازي DNA کلونيهاي جدا شده 115 3-2-4-26- تهيه مخلوط اصلي اوليه 115 3-4-26- پرايمرها 115 4-26- واکنش PCR 117 5-26- تهيه ژل الکتروفورز 118 1-5-26- طرز تهيه محلول اتيديوم برمايد 119 6-26- الکتروفورز 121 7-26- رويت باندهاي ايجاد شده 122 فصل سوم: نتايج 27- نتايج 124 1-27- جداسازي 124 1-1-27- بررسي عملکرد محيط کشت 124 2-1-27- نتايج کشت نمونه هاي ارسالي 124 1-2-1-27- نتايج روز پنجم 125 2-2-1-27- نتايج روزهفتم تا دهم 125 3-2-1-27- نتايج روزپانزدهم 126 2-27- نتايج PCR 126 1-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر جنس 126 2-2-27- تائيد کلوني هاي جدا شده 127 3-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر کلاستر مايکوئيدس 127 4-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه آگالاکتيه 128 5-2-27- نتايج PCR نمونه ها با پرايمر گونه مايکوئيدس کلوني بزرگ 129 3-27- نتايج کالبد گشايي 130 1-3-27- معيار انتخاب 130 فهرست عنوان صفحه فصل چهارم: بررسي نتايج نمودارها 131 فصل پنجم: بحث 28- بحث 139 1-28- ضايعات کالبد گشايي 139 2-28- ميزان وقوع عفونت تنفسي مايکوپلاسما 141 3-28- روش کشت 142 4-28- روش PCR 147 5-28- فراواني گونه ها 152 29- خلاصه انگليسي 159 30- منابع 160 فهرست تصاوير عنوان صفحه تصوير شماره 1: کلوني تخم مرغي شکل مايکوپلاسما پس از سومين ساب کالچر 125 تصوير شماره 2: آزمايش PCR براي تشخيص جنس مايکوپلاسما در نمونه ريه 127 تصوير شماره 3: آزمايش PCR براي تشخيص کلاستر مايکوئيدس در نمونه ريه 128 تصوير شماره 4: آزمايش PCR براي تشخيص گونه آگالاکتيه درنمونه ريه 129 تصوير شماره 5: آزمايش PCR براي تشخيص گونه مايکوئيدس مايکوئيدس کلوني بزرگ 130 فهرست جداول عنوان صفحه جدول1: طبقه بندي مايکوپلاسما 11 جدول 2: معرفي اعضا کلاستر مايکوئيدس و خصوصيات بيماريزايي آنها 11 جدول 3: احتياجات غذايي براي رشد مايکوپلاسماهاي کلاستر مايکوئيدس 39 جدول 4 : مقادير موردنياز جهت تهيه مخلوط اصلي اوليه 112 جدول 5: مواد مورد نياز واکنش تکثير 114 جدول6 : پرايمرهاي استفاده شده در واکنش تکثير 116 جدول 7 : برنامه واکنش پرايمرها 118 جدول8: : فرمول تهيه محيط TBE(5X) 120 جدول9: ميزان اتيديوم برومايد مصرفي جهت ساختن مقادير متفاوت ژل 120 فهرست نمودارها عنوان صفحه نمودار شماره 1: درصد مايکوپلاسماي جدا شده به روش کشت در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه 132 نمودارشماره 2: درصد حضور مايکوپلاسما درعفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه به روشPCR 132 نمودار شماره3 : مقايسه روشهاي کشت و PCR در تشخيص مايکوپلاسما ي موجود در عفونت تنفسي گله‌هاي مورد مطالعه 133 نمودار شماره4: مقايسه نتايج کشت وPCR نمونه‌ها در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 133 نمودار شماره 5: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گاو (n=50) 134 نمودار شماره 6: مقايسه نتايج کشت و PCR مايکوپلاسما در گله هاي گوسفند (n=30) 134 نمودار شماره 7: مقايسه نتايج کشت و PCR در گله‌هاي بز (n=20) 135 نمودار شماره8: نمودار شماره 8:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 135 نمودار شماره 9: نمودار شماره9:مقايسه نتايج ايجاد کدورت در محيط براث و جداسازي مايکوپلاسما در گله‌هاي مورد مطالعه (n=100) 136 نمودار شماره 10: نمودار شماره10: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گاو(n=50) 136 نمودار شماره 11: نمودار شماره 11:مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي بز (n=20) 137 نمودار شماره12: مقايسه نتايج تشکيل کدورت در محيط براث و PCR مايکوپلاسما در گله‌هاي گوسفند (n=30) 137